糖尿病视网膜病变患者血清circFTO和miR-141-3p表达情况及其与病变分期的关系

田 涛,刘 茹,彭婧利,邝国平,周小平,姚晓喜

0 引言

中国是受糖尿病影响人数最多的国家,糖尿病可能导致心血管、脑血管、神经性、肾病、视网膜病和足部疾病,给医疗系统带来了巨大负担[1]。糖尿病不仅会影响血管自动调节,也会损害微血管系统,尤其是视网膜和视神经[2]。其中糖尿病视网膜病变是糖尿病常见的微血管并发症,也是造成视力下降的主要原因[3]。因此,糖尿病视网膜病变的早期检测有助于预防和治疗。环状RNA(circRNA)在眼部疾病中的作用引起了越来越多的关注,其中circFTO(又称circ_0005941)可通过上调硫氧还蛋白相互作用蛋白促进血管生成并损害血视网膜屏障[4]。微小RNA-141-3p(microRNA-141-3p,miR-141-3p)可通过抑制含有sushi结构域的蛋白2促进视网膜母细胞瘤患者的疾病进展[5]。本研究旨在检测不同疾病分期糖尿病视网膜病变患者血清circFTO、miR-141-3p水平变化,探讨二者水平与疾病进展的关系。

1 对象和方法

1.1 对象选取2019-10/2022-11本院收治的198例2型糖尿病患者为研究对象,患者年龄36～78岁,根据我国糖尿病视网膜病变诊疗指南将患者分为非糖尿病视网膜病变(nondiabetic retinopathy,NDR)组70例、非增殖期糖尿病视网膜病变(nonproliferative diabetic retinopathy,NPDR)组66例、增殖期糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)组62例;同期选取67例本院体检正常的志愿者作为对照组,年龄34～78岁。纳入标准:(1)患者分期符合《我国糖尿病视网膜病变诊疗指南(2014年)》[6]及中华医学会糖尿病视网膜病变分期标准;(2)视网膜病变患者眼底检查发现视网膜有出血、渗血、新生血管等;(3)未合并糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变等其他糖尿病微血管病变者。排除标准:(1)急慢性感染、血液系统疾病、肝肾等脏器功能障碍者;(2)有高血压视网膜病变及其他引起视网膜出血的眼底病变者;(3)已行视网膜激光光凝术者;(4)合并恶性肿瘤疾病、严重心脑血管疾病者。本研究受试者均签署知情同意书,通过本院临床研究伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集收集四组年龄、性别、体质量指数(BMI)、病程、吸烟史、饮酒史、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)。

1.2.2 血清circFTO和miR-141-3p水平检测采集空腹5mL外周静脉血样,室温放置一段时间后,离心机3500r/min转速离心处理10min,保留上层血清置于-80℃保存待测。采用RNA提取试剂盒(北京康润诚业生物科技有限公司,P118)提取血清中的RNA,使用cDNA第一链合成试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司,货号:FFS-25)将RNA反转录为cDNA,引物序列见表1,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法检测血清circFTO和miR-141-3p水平。配制反应体系后依照以下程序反应:95℃预热3min;95℃ 15s,60℃ 15s,72℃ 15s,重复40个循环。反应结束后根据循环曲线分析CT值,分别以GAPDH和U6为内参,采用2-ΔΔCT法计算circFTO和miR-141-3p相对表达量,引物由北京华大基因公司合成。

表1 引物序列

2 结果

2.1 四组一般资料比较四组年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、TG、TC、LDL-C比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。PDR组SBP、DBP高于对照组、NDR组、NPDR组,HDL-C低于对照组、NDR组、NPDR组(均P<0.05)。NDR组、NPDR组、PDR组FPG、HbA1c高于对照组(均P<0.05)。PDR组病程高于NDR组、NPDR组(均P<0.05),见表2。

表2 四组一般资料比较

2.2 四组血清circFTO和miR-141-3p水平比较PDR组血清circFTO水平显著高于对照组、NDR组、NPDR组,miR-141-3p水平显著低于对照组、NDR组、NPDR组(均P<0.05),见表3。

表3 四组血清circFTO和miR-141-3p水平比较

2.3 糖尿病视网膜病变患者血清circFTO和miR-141-3p与各指标间的相关性Pearson相关分析结果显示,糖尿病视网膜病变患者血清circFTO与miR-141-3p呈负相关(r=-0.450,P<0.05),见图1。糖尿病视网膜病变患者血清circFTO、miR-141-3p与年龄、BMI、病程、TG、TC、LDL-C、HDL-C无显著相关性(均P>0.05)。circFTO与SBP、DBP、FPG、HbA1c呈正相关(均P<0.05),miR-141-3p与SBP、DBP、FPG、HbA1c呈负相关(均P<0.05),见表4。

图1 糖尿病视网膜病变患者血清circFTO与miR-141-3p的相关性。

表4 糖尿病视网膜病变患者血清circFTO和miR-141-3p与各指标间的相关性

2.4 糖尿病视网膜病变影响因素的多因素Logistic回归分析将糖尿病视网膜病变是否发生(赋值:0=否,1=是)作为因变量,以circFTO、miR-141-3p、SBP、DBP、FPG、HbA1c为自变量进行多因素Logistic回归分析(逐步回归进行变量筛选),结果表明,circFTO是影响糖尿病视网膜病变的危险因素,miR-141-3p是影响糖尿病视网膜病变的保护因素(P<0.05),见表5。

表5 糖尿病视网膜病变影响因素的多因素Logistic回归分析

3 讨论

根据疾病不同时期可将糖尿病视网膜病变分为NPDR和PDR,NPDR的早期标志包括血管内皮损伤、微动脉瘤的形成和视网膜内点状出血[7-8]。随着疾病进一步发展,血管收缩和毛细血管闭塞导致视网膜缺血,糖尿病视网膜病变进展至末期,严重缺氧会造成新生血管、玻璃体出血和视网膜脱离[9-10]。若能早期发现、早期诊断、有效治疗,可延迟糖尿病视网膜病变的发作及进展,为其诊治提供帮助。

本研究结果显示,健康人群、NDR患者、NPDR患者、PDR患者中SBP、DBP、HDL-C、FPG、HbA1c存在显著差异,与张秋艳[11]研究结果部分一致。提示血糖、血脂代谢异常在糖尿病视网膜病变发生、发展中发挥重要作用,可导致病情加重。

circRNA是通过前mRNA的反向剪接产生的,circRNA的闭环结构比线性RNA更为稳定,目前circRNA作为miRNA海绵的调节机制已有研究[12-13]。既往研究显示,miRNA可通过与mRNA的碱基配对,抑制mRNA的翻译并下调特定基因表达,这是circRNA下游的主要调控机制[14]。本研究结果显示,随着糖尿病视网膜病变的发展,血清circFTO水平逐渐增加,miR-141-3p水平逐渐降低。推测:(1)circFTO、miR-141-3p可能通过影响炎症反应参与疾病进展。Huang等[15]研究发现,circFTO的缺失可以抑制氧化应激和炎症,进而减少高糖诱导的人视网膜色素上皮(adult retinal pigment epithelium-19,ARPE-19)细胞损伤。而既往研究中miR-141-3p是具有炎症抑制作用和神经保护作用的miRNA[16-18]。基于上述研究分析推测本研究糖尿病视网膜病变发生初期,患者视网膜屏障的通透性和流动性发生改变,造成许多功能受损,患者血清miR-141-3p水平降低,miR-141-3p表达缺失造成circFTO大量表达,进而诱导炎性因子大量释放,加重炎症水平,加速血液-视网膜屏障的破坏及多种炎性细胞因子的进一步释放,最终可能会导致新生血管、玻璃体出血和视网膜脱离。(2)circFTO、miR-141-3p可能通过影响血管生成参与疾病进展。Liu等[5]研究中,miR-141-3p过表达增加了视网膜母血管瘤的生长与血管生成。基于上述研究分析推测本研究糖尿病视网膜病变发生后,病理损伤造成circFTO、miR-141-3p表达异常,进而协调促进病理性视网膜新生血管生产,推动病理进展。(3)circFTO、miR-141-3p可能通过影响细胞功能参与疾病进展。既往研究结果表明,糖尿病视网膜病变的具体机制目前尚未完全阐明,除涉及非特异度炎症和氧化应激外,还包括细胞凋亡等多种病理生理过程[19]。而Yang等[14]研究结果表明,circFTO表达上调可能促进肾透明细胞癌细胞的增殖和侵袭能力。此外,Tang等[20]研究表明,人参皂苷Rh3可通过诱导小鼠视网膜中miR-141、核因子E2相关因子2表达增加,保护视网膜细胞免受紫外线伤害。推测本研究中circFTO、miR-141-3p表达异常,亦可能通过调控视网膜细胞功能参与糖尿病视网膜病变。

本研究相关性结果进一步显示,circFTO、miR-141-3p与FPG、HbA1c水平显著相关。提示circFTO、miR-141-3p水平变化可能与长期血糖控制水平相关,推测circFTO异常升高和miR-141-3p异常降低可能通过慢性调节血糖变化加速糖尿病视网膜病进展。进一步多因素Logistic回归分析发现,circFTO、miR-141-3p均是糖尿病视网膜病变的影响因素。提示circFTO水平增加、miR-141-3p水平降低一定程度上反映出血糖控制不佳,间接提示糖尿病视网膜病变的严重程度,二者可能共同参与疾病进展。

综上所述,circFTO、miR-141-3p可能参与了糖尿病视网膜病变的发生发展,且与疾病分期密切相关,动态监测二者水平变化有助于评估疾病病变程度。然而circFTO、miR-141-3p参与糖尿病视网膜病变的具体作用机制不明确,仍需基础研究证实。且本研究未对糖尿病视网膜病变患者治疗前后的血清circFTO、miR-141-3p水平进行对比分析,未探讨二者在疾病治疗中的价值。