假性剥脱性青光眼的生物标志物研究进展

黄 悦,李 妍,包郑伊琳,李玉婷,喻永沅,胡竹林

0 引言

青光眼是一组与视神经变性相关并导致视力丧失的复杂疾病。据估计,全球青光眼患者人数约为7600万,预计到2040年将达到1.118亿[1]。假性剥脱性青光眼(pseudoexfoliation glaucoma,PEXG)是继发性青光眼的主要类型[2],主要由假性剥脱综合征(pseudoexfoliative syndrome,PEX)发展而来,约有20%的PEX患者伴有PEXG。PEX是一种全身性微纤维病,其眼部特征是异常的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)重构,脱落性物质在眼睛不同位置堆积,逐渐引起进行性纤维化,导致小梁网(trabecular meshwork,TM)功能障碍,房水(aqueous humor,AH)流出受阻,眼压(intraocular pressure,IOP)升高,最终造成视神经不可逆性损伤[3]。研究发现,PEXG产生的纤维蛋白聚集物主要来自虹膜、晶状体和睫状体上皮细胞[4]。PEXG较原发性开角型青光眼更具侵袭性,预后更差,且对治疗有较高的耐药性[5]。

1 PEXG的生物标志物

由于PEXG早期无典型临床症状,导致大多数患者被发现时已是晚期,所以,目前国内外学者对PEXG患者体液进行基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学以及脂质组学分析,希望找到PEXG相关的分子标志物,对其早期诊断及治疗提供一定帮助,本文将对PEXG生物标志物的研究进展进行阐述。

1.1 基因组学遗传因素被认为是青光眼发病的重要因素[6]。目前与PEXG患者相关的基因,主要是细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂2B反义非编码RNA(CDKN2B-AS1)基因、类赖氨酸氧化酶1(LOXL1)基因、STRA6、SIRT1、FOXO1和FOXO3a基因、IL-10基因、ABCA1和FNDC3B基因以及ACVR1基因。

最近的全基因组关联研究(whole genome association research,GWASs)发现CDKN2B-AS1基因组区与青光眼遗传多态性密切相关,CDKN2B-AS1控制两种细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂2A和2B(CDKN2A和CDKN2B)的转录,它们阻断细胞周期的第一个阶段(frist gap,g1)期,通过转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)通路抑制细胞增殖[7-8]。此外,CDKN2B-AS1基因所在的9p21,3号染色体被GWASs鉴定为是杯盘比增大的重要易感位点,与青光眼发病密切相关,此基因通过上调TGF-β表达水平,使视乳头杯盘比增大[9-11]。还有研究表明,眼压升高与CDKN2B过表达相关[12]。Eliseeva等[13]研究发现,CDKN2B-AS1基因与俄罗斯中部高加索人PEXG风险增加相关。

PEXG中研究最多的基因家族是LOXL基因,尤其是LOXL1基因,它表达的类赖氨酸氧化酶可以催化纤维胶原和弹性蛋白的细胞外交联[14]。LOXL1基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNPs)编码区有2个非同义链,即rs1048661和rs3825942,它们位于LOXL1蛋白的前肽段,主要促进细胞外基质蛋白底物结合并催化弹性纤维的形成[15]。Vallabh等[16]发现rs3852942(G153D)的G等位基因与印度人PEXG的发病密切相关。Papadopoulou等[17]发现在希腊人群中,LOXL1内含子多态性rs11638944与PEXG之间存在显著的统计学关联。兰兰等[18]发现PEXG中国患者LOXL1基因rs1048661位点基因型GG及等位基因G明显高于正常人。Eivers等[19]发现,在爱尔兰人群中LOXL1基因的SNPs是发生PEXG的重要危险因素。Greene等[20]进一步研究发现,在PEXG患者中,LOXL1启动子甲基化水平较正常人升高,表明LOXL1的差异表达是通过DNA甲基化调控的。Berner等[21]通过对LOXL1基因进行深度测序,发现了一个常见的非编码序列rs7173049A>G,它位于LOXL1的下游,该序列影响邻近基因STRA6的表达水平,在PEXG的眼组织切片中,STRA6表达明显减弱,并伴随眼部纤维异常聚集。

Yaman等[22]发现PEXG患者TM组织中SIRT1、FOXO1和FOXO3a基因相对于对照基因(GAPDH)的表达量降低。SIRT1去乙酰化多种底物,包括FOXO转录因子、p53和NF-kβ等免疫调节因子[23]。FOXO转录因子是SIRT1在细胞低能量状态下的关键底物。FOXO1和FOXO3a通过SIRT1依赖的去乙酰化作用对细胞应答代谢变化和氧化应激的能力具有潜在影响[24]。

IL-10基因启动子区有3种常见的SNPs-592C/A(rs1800872)、SNPs-819C/T(rs1800871)和SNPs-1082A/G(rs1800896)。这些SNP控制IL-10 mRNA的转录和IL-10蛋白的表达。Fakhraie等[25]研究表明,在伊朗人群中,IL-10基因启动子TT基因型的-819C/T和AA基因型的-1082A/GSNP与PEXG的易感性显著相关。

Kondkar等[26]研究发现,沙特人群中ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)基因和Ⅲ型纤维连接蛋白结构域蛋白3B(type Ⅲ fibronectin domain protein 3B,FNDC3B)基因多态性与PEXG相关。ABCA1基因可编码ABCA1蛋白,对机体胆同醇的转运和高密度脂蛋白的形成发挥重要作用[27]。FNDC3B是纤维连接蛋白家族的一员,其编码的细胞外基质蛋白参与TGF-β信号转导[28]。研究发现,这两种基因在人类视网膜、视神经、小梁网和视网膜神经节细胞中都高度表达,其可能在青光眼发生发展中起着重要作用[8]。在沙特人群中ABCA1基因rs2472493多态性和FNDC3B基因rs7636836多态性可能与男性PEXG有关[26]。

激活素A受体Ⅰ型(activin A receptor type Ⅰ,ACVR1)基因也与青光眼的发病密切相关。ACVR1是TGF-β受体亚家族的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)Ⅰ型受体[29]。BMP在细胞中控制多种生物功能,通过与细胞表面BMPⅠ型和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合来诱导信号转导。BMP结合配体后,Ⅱ型BMP受体磷酸化Ⅰ型BMP受体,启动下游BMP信号通路,调节靶基因的转录[30]。Kondkar等[31]研究表明,在沙特人群中,参与BMP信号通路的ACVR1基因rs12997多态性与PEXG显著相关。

遗传背景和环境因素在人类疾病的发病机制中发挥着重要作用,以上不同基因的多态性会增加不同种族及不同性别PEXG发病风险,但其潜在机制尚不完全清楚。在未来研究中,还需在大样本队列中进行重复,进一步验证目前的研究。如果逆转这些表观遗传变化,将来可能成为PEXG潜在的早期诊断治疗靶点,对PEXG患者提供新帮助。

1.2 转录组学miRNA是一种小的非编码RNA,参与RNA沉默和转录后水平的基因表达调控,调节多种细胞功能[32]。研究发现,miRNA主要作用于细胞内,也可存在于体液中,细胞外miRNA有可能作为青光眼的生物标志物[33]。

Rao等[34]采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)阵列对PEXG患者的外周血进行miRNA分析,观察到84个miRNA中有12个在高眼压期显著下调,而PEXG期这些miRNA显著上调。他们进一步分析了哪些KEGG通路富集了12个显著差异表达的miRNA,发现hsa-miR-122-5p、hsa-miR-124-3p和hsa-miR-424-5p在靶向的参与TGF-β1、ECM纤维化和蛋白多糖代谢3个特定通路,在PEXG中上调。Kosior-Jarecka等[35]研究发现hsa-miR-6722-3p和hsa-miR-184在PEXG中表达更频繁,在更晚期的PEXG患者中hsa-miR-1260b的表达水平降低,hsa-miR-1260b可能在青光眼神经病变过程中发挥保护作用。

以上几种miRNA通过上调或下调表达在PEXG的发病过程中发挥着重要作用,进一步研究这些转录组学生物标记物,对该疾病的早期诊断具有重大意义。

1.3 蛋白组学蛋白质磷酸化、乙酰化、甲基化和其他翻译后修饰是机体信号转导的必要条件。蛋白组学常用于揭示基于mRNA层面未能解释的疾病特征,被广泛应用于生物标志物和疾病的发病机制研究。

PEXG是一种纤维化疾病,其发病与纤维化蛋白密切相关。类赖氨酰氧化酶蛋白1(lysine oxidase like protein 1,LOXL1)、前胶原C端蛋白酶增强子(PCOLCE)蛋白、纤维蛋白5(fibulin-V)、纤维连接蛋白1(fibronectin 1,FN1)、热休克蛋白(HSP)27、网格蛋白均参与机体纤维化的形成,其异常表达可能导致PEXG的发生。Sahay等[36]对PEXG晶状体囊(lens capsule,LC)样本进行液相色谱-串联质谱分析,发现有27个蛋白过表达,其中LOXL1在PEXG中的表达量很高。他们还通过免疫组化发现在PEXG LC中PCOLCE蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)高表达。PCOLCE蛋白会去除ECM前胶原Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中的c-前肽,导致胶原沉积,α-SMA诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转变[37]。纤维连接蛋白5(fibronectin-V,FN5)是一种在弹性纤维形成中起重要作用的ECM蛋白,在PEXG的LC中表达较高[38]。Sahay等[39]还发现,PEXG患者的AH和血清中TGF-β1、FN1蛋白的表达量明显升高。PEXG泪液中转化生长因子-α(transforming growth factor-α,TGF-α)、巨噬细胞衍生趋化因子(macrophage derived chemokines,MDC)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生长因子-AA(platelet derived growth factor-AA,PDGF-AA)显著下调,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、γ干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、巨噬细胞炎症蛋白-1β(macrophage inflammatory protein-1 β,MIP-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)水平显著上调,提示这些蛋白分子可能是PEXG潜在标志物。HSP家族是机体应激时表达的蛋白质,HSP27在多种组织纤维化中异常表达[40]。Reinehr等[41]发现,HSP27在PEXG患者中表达上调。网格蛋白是一种纤维蛋白,主要参与介导细胞内吞作用,Beutgen等[42]研究发现PEXG患者的血清抗网格蛋白抗体水平降低。

研究发现,氧化应激、炎症与青光眼的发病密切相关,Tang等发现氧化应激在PEXG的发病中起着突出作用[6,43]。Klotho是一种膜依赖性可溶性抗衰老蛋白,常见于大脑和肾脏,可调节磷酸盐、钙和维生素D代谢,还可以抑制氧化应激[44]。Tokuc等[45]研究发现PEXG患者血清和体液中Klotho水平显著低于正常人。轴突导向因子(axon guidance factor,Netrins)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)以及聚簇蛋白(cluster protein,clusterin)都是与机体炎症反应相关的蛋白质。Netrins是一个糖蛋白结构中高度保守的引导小分子家族,Netrin家族有5个确定的成员:蛋白1,蛋白3,蛋白4,蛋白g1和蛋白g2。Netrin-1在炎症抑制中具有重要作用[46]。Okutucu等[47]发现PEXG患者血清netrin-1水平降低。Kondkar等[48]研究发现高TNF-α水平可能是PEX向PEXG进展的一个标志物。最近还有研究发现PEXG前房clusterin水平较高[49-50]。clusterin在细胞聚集、补体抑制、脂质转运、炎症和凋亡中具有重要作用[51]。

总之,在PEXG患者中,我们通过研究PEXG发病相关蛋白的详细信息,有助于了解PEXG的发病机制,从众多蛋白组学标志物中挑选出重要的标记物,这些标记物可作为PEXG诊断及治疗的潜在靶点。

1.4 代谢组学代谢组学作为继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后发展起来的系统生物学的一个新的分支,它主要研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢产物的变化,研究对象主要是相对分子质量1000以下的内源性小分子[52]。PEXG的发病与代谢物在TM的堆积密切相关,近几年,越来越多的人开始研究PEXG的代谢组学生物标志物。

Myer等[53]采用核磁共振谱技术(nuclear magnetic resonance spectroscopy technology,NMR)和同位素比值异常值分析(analysis of outlier of isotope ratio,IROA)联合方法鉴定了298种代谢物。对非氨基酸、非脂质代谢物的比较显示,与正常对照相比,PEXG中不对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)的含量更高,考虑可能是L-精氨酸在PEXG中转化为ADMA。与POAG相比,PEXG中5-羟基戊酸显著升高,微粒体谷胱甘肽S转移酶1(MGST1)下调。前文中提到PEXG被证明与氧化应激密切相关,MGST1是一种与氧化应激保护相关的蛋白。

Cetinkaya等[54]发现PEXG患者的总抗氧状态(TAS)水平较低,总氧化状态(total oxidation state,TOS)水平较高,且总硫醇和天然硫醇水平明显低于POAG以及正常对照组。硫醇是一类含有巯基(-SH)的有机衍生物,在氧化还原稳态中起着重要作用,主要保护细胞免受自由基应激[55]。但Ergan等[56]研究发现,PEXG患者的TAS及TOS水平均明显高于正常组。这两种相互矛盾的结果考虑与PEXG的病程相关,在疾病发展的早期,抗氧化活性增加,伴随着病程变化,机体抗氧化能力逐渐下降。Zenkel等[57]发现,维甲酸(retinoic acid,RA)信号缺陷与TGF-β1/Smad信号过度激活是PEXG纤维化形成的驱动因素,恢复RA信号可能是PEXG患者抗纤维化干预的有效措施。Eraslan等[51]发现PEXG病例中酰基化胃饥饿素/胃饥饿素比值升高,酰基化胃饥饿素可能通过负向调节前列腺素和一氧化氮的释放在PEXG发病中发挥作用。

目前,对于PEXG患者的代谢组学分析主要是收集患眼的AH进行检测,理论上,最好在单眼PEXG的患者进行双眼AH收集,这可以更好的预测PEXG患者健康眼未来的发病情况,以及预测疾病的严重程度。但为了防止穿刺对健康眼造成损伤,临床上并不允许对未受影响眼进行穿刺。在未来的研究中,我们还可以进一步对患者AH与血液代谢物进行对比,研究两者是否以不同的准确度提供相同的PEXG诊断,有助于临床预测易感性,了解疾病进展和药物疗效。

1.5 脂质组学脂质组学属于代谢组学一个新的分支,主要用于研究机体不同状态下各种脂类化合物的变化及相应功能。脂质代谢物,特别是它们的过氧化产物,被推测为氧化应激的生物标志物[58]。脂类化合物在机体不同生理、病理条件下发生动态改变[59-60]。

Collao等[61]从AH样本的26种脂类物质中发现了489种脂质,在PEXG AH中,多种胆固醇酯(cholesteryl ester,ChEs)、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PCs)、甘油三酯(triglyceride,TG)和神经酰胺(ceramide,Cers)的浓度明显升高。并且PEXG AH中链长为20的脂质富集最显著,链长为48的脂质缺损最显著。此外,还发现含有5个双键的脂质物最富集,而含有1个双键的脂质物最缺乏。目前,在PEXG的生物标志物中,还没有足够的研究来证实蛋白质组、脂质组和代谢组是如何相互作用的。Collao等[61]进一步研究发现蛋白质组和脂质组AH存在相关性,如载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-1,APOA1)的升高与PEXG患者AH中磷脂(phospholipid,PC)丰度增加相关。

国内外目前关于PEXG脂质组学的研究还相对较少,毋庸置疑,脂质组学在PEXG的发病中扮演着十分重要到角色,希望将来会有更多的研究来完善PEXG脂质组学生物标志物。

2 总结与展望

综上,PEXG是一种严重威胁人类健康的眼部疾病,其对视神经的损害较其他类型青光眼更为严重,该病缺乏有效的早期诊断手段,发现时多为晚期,已对视神经发生不可逆的损害。目前人们正在进一步完善PEXG基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学以及脂质组学生物标志物的研究,有助于进一步了解该病的发病机制,希望在众多的生物标志物中,能够挑选出几种最佳标志物,在未来通过这些生物标志物能对PEXG实现靶向诊断以及治疗,减轻人们的疾病负担。