糖尿病合并颈动脉狭窄患者中Ang Ⅱ调节T 细胞活性的相关研究

王 凯，金 凤

（1.内蒙古医科大学附属医院神经外科，内蒙古 呼和浩特 010050；2.内蒙古医科大学附属医院影像诊断科，内蒙古 呼和浩特 010050）

2 型糖尿病（T2DM）是由于各种原因导致的胰岛素分泌不足和胰岛素敏感性缺乏的一种疾病。T2DM 的发病率逐年上升，糖尿病及其并发症的治疗[1]是世界范围的问题，对于家庭和社会产生的经济负担巨大。T2DM 与周围血管病、脑血管病和冠状动脉疾病的发病密切相关[2]。T2DM 中动脉粥样硬化的发病机制仍是亟待解决的问题，对其机制的研究也是目前热点。

免疫紊乱是引起T2DM 并发症的主要原因，报道也较多[3]。免疫紊乱与T 淋巴细胞密切相关。T淋巴细胞分为不同亚型和类别，主要亚型有Th1、Th2和Th17，产生不同类型炎症相关因子，从而导致感染和免疫内环境稳态破坏[4]。有证据证实特定的T细胞亚型对Ang Ⅱ诱发的高血压和相关血管紊乱疾病有潜在的影响[4]。所以，我们考虑T 细胞亚型（Th1、Th2 和Th17）可能参与了T2DM 患者的颈动脉粥样硬化（carotid atherosclerosis stenosis，CAS）形成；T 细胞亚型可能会促发Ang Ⅱ相关T2DM 患者的颈动脉粥样硬化的形成和发展。

为了证实我们的推测，在T2DM 患者合并或不合并CA中，研究T细胞亚型的表达。同时研究作为对照组的健康体检者外周血单核细胞中分离出的T细胞亚型（Th1、Th2 和Th17），应用Ang Ⅱ刺激剂或Ang Ⅱ拮抗剂治疗后的T 细胞的变化，进而推测Ang Ⅱ调节T 细胞变化可能促进T2DM 患者的颈动脉粥样硬化形成。现报道如下。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象

选取2019年9月至2021年6月诊断为2型糖尿病的患者200 例。根据颈部彩超结果，所有患者被分成两组，CA 组（2 型糖尿病合并颈动脉狭窄组）100 例和T2DM 组100 例，另外选30 例健康体检者。根据美国糖尿病协会标准，糖尿病的诊断基于血糖水平和糖化血红蛋白（HbA1c）水平（血糖水平＞200mg/dL and HbA1c ＞6.5%）。纳入标准：劲动脉狭窄经过我院彩超鉴定狭窄≥30%。排除标准：（1）高血压；（2）冠心病；（3）充血性心衰；（4）急性或慢性炎症；（5）脑卒中病史；（6）肝功能不全和或肾功能不全；（7）肿瘤和或风湿性疾病；（8）抗炎药物史如非甾体抗炎药物、类固醇药物和其他等。同时，30 例健康体检者作为对照组。对基本特征（包括年龄、性别、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、高血压病史、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、吸烟）进行收集和记录整理。

1.2 血样处理

禁食情况下肘静脉采血分装到两个真空采血管中，一支用肝素抗凝，离心后分离出上清液装到无菌EP 管中，之后保存在-80 ℃，用来进行IFN-γ、IL-4 以及IL-17水平的检测。下层细胞用来分离外周血单核细胞（PBMCs）。另外一支试管装有乙二胺四乙酸（EDTA）酶抑制剂，在3000 r/min离心4～5 min后，分离出来的血浆装到无菌EP管中保存在-80 ℃用来检测Ang Ⅱ。

1.3 分离和培养PBMCs

用聚蔗糖泛影钠的密度梯度离心法从全血细胞中分离出单核细胞（2500 r/min，10 min）。之后通过磁单元细胞用Miltenyi Biotech 工具（根据说明书）分离单核细胞。用流式细胞术检测PBMCs 的纯度。分离的PBMCs 放在RPMI1640 培养基中，培养基中包括10%牛胎儿血清（FBS）和增补的2 mm 左旋谷酰胺，100 U/mL 青霉素和100 g/mL 链霉素，37 ℃，5%CO2保温箱。

与此同时，从健康体检者分离出的PBMCs 分成8组，分别用0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L Ang Ⅱ有或没有氯沙坦（一种Ang Ⅱ拮抗剂；默克和默沙东，英国）作用48 h。

1.4 流式细胞术测定Th1、Th2以及Th17细胞比例

分离出的PBMCs平铺于24孔板中以2×105cells/孔培养并进行检测。培育24 h 后，25 ng/mL 聚丙烯酸甲酯（PMA）、50 ng/mL 伊乌诺霉素以及1 μL 莫能霉素加到每个孔中并在37 ℃保存和操作，5% CO2保温箱中保存4 h，以300 r/min离心分离10 min重悬细胞，加入兔血清封闭30 min，加入兔抗人CD4-PE抗体避光孵育20 min。用PBS液体清洗后按说明书加200 μL固定液固定10 min，用1 mL破膜液体作用10 min。细胞用鼠抗人FITC-IFN-γ、FITC-IL-4以及FITC-IL-17孵育培养，分别在黑暗条件下孵育20 min。最后通过流式细胞术检测Th1（positive with FITCIFN-γ）、Th2（positive with FITC-IL-4）以及Th17（positive with FITC-IL-17）比例。

1.5 实时反转录聚合酶链反应（RT-PCR）

应用试剂盒从PBMCs中提取总RNA，根据说明书用cDNA 组合体（Toyobo，Japan）逆转录。实时荧光定量RT-PCR用绿色试剂盒（TaKaRa，Shiga，Japan）在iQ5 检测系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）上进行。过程如下：95 ℃for 4 min；45 cycles of 95 ℃for 5 sec以及62 ℃for 30 sec；

引物序列（Invitrogen，Carlsbad，CA），被用来扩增如下：

基因表达的逆转录使得β-actin 标准化和用2-ΔΔCt方法测定。每个样本做3次，并且每个数据验证3次。

The fold-change of gene expression was normalized to βactin and calculated using the2-ΔΔCt method. Each sample was

repeated in triplicates and all the experiments were conducted for three times.

1.6 酶联免疫吸附试验（ELISA）

血浆中Ang Ⅱ、IFN-γ、IL-4以及IL-17的水平用ELISA 法检测（Bender 试剂盒，Vienna，Austria），根据产品说明书操作。在溶液中反应30 min，用酶标仪（BIORAD，USA）测定，定在450 nm。

1.7 统计学方法

所有的数据均采用均数±标准差（±s）表示，应用SPSS 18.0 软件统计分析（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）。组间比较用one-way ANOVA，组内比较LSD 检验。检验水准为α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 所有病例的基本情况和Ang Ⅱ水平

所有参与者的基本情况如表1所示。三组患者中年龄、血糖、总胆固醇和低密度脂蛋白明显不同，差异有统计学意义（P＜0.05）。吸烟和高血压在CA组和T2DM组多于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。然而，三组患者中性别、甘油三酯、高密度脂蛋白、收缩压和舒张压组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。此外，Ang Ⅱ水平CA组（80.66±17.20）pg/mL明显高于T2DM组（35.49±15.01）pg/mL和对照组（35.14±0.43）pg/mL，差异有统计学意义（见表1）。

TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；SBP：收缩压；DBP：舒张压；Ang Ⅱ：血管紧张素Ⅱ。

2.2 T细胞活性的变化

不同组间外周血单核细胞中Th1、Th2 和Th17细胞比例应用流式细胞术（见图1）。Th1 和Th17阳性细胞数在CA组明显高于T2DM组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；T2DM 组和对照组，差异无统计学意义（P＞0.05）。另外，Th2 细胞比例在三组间，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 流式细胞法检测的Th1, Th2和Th17

T-bet，GATA3 和RORγt 分别作为Th1、Th2 和Th17 的转录因子，也是用外周血单核细胞，应用RT-PCR 试验检测（图2A）。同样得到，T-bet 和RORγt水平在CA组明显高于T2DM组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但是GATA3 水平在三组中表达相似，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2A和图2B 不同组间T细胞的表达因子的表达情况A 不同组间T-bet、GATA3 和RORγt mRNA 水平的表达（PCR）；B 不同组间血浆中IFN-γ、IL-4 和IL-17 表达情况（ELISA）。Column:mean,n=3 and bar:SD；**P ＜0.01 vs control group.

血浆中作为Th1、Th2和Th17的特征因子IFN-γ、IL-4 和IL-17 在CA 组、T2DM 组和对照组进行比较（图2B）。在CA 组IFN-γ 和IL-17 的表达比T2DM 组和对照组明显上调，然而IL-4 水平保持不变（P＞0.05）。

2.3 Ang Ⅱ水平的比较

CA 组Ang Ⅱ水平（80.66 ± 17.20）pg/mL 明显高于对照组（35.14 ± 0.43）pg/mL 和T2DM 组（35.49±15.01）pg/mL，差异有统计学意义（P＜0.05）；后两组组间比较差异无统计学意义（见图3）。

图3 三组患者血浆中Ang Ⅱ水平的比较

2.4 培养PBMCs中效应T细胞比例以及加入Ang Ⅱ和/或ARB后效应性T细胞比例变化的比较

PBMCs 从健康人外周血分离出来后分成8 组，分别加入0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L Ang Ⅱ，不加ARB 的组效应T 细胞的变化以及和分别加入0.1 μmol/L ARB作用48 h的变化，见图4。Th1和Th17细胞的活性，随着加入0 μmol/L，0.1 μmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L Ang Ⅱ浓度的增大而表达增高，在10 μmol/L Ang Ⅱ刺激组达到最大效应，与对照组相比，Th1细胞比例增加1倍多，Th17细胞比例增加4倍。在0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 不同浓度Ang Ⅱ组中均设置相应浓度的氯沙坦（ARB）预处理各个亚组。我们看到的结果是，Ang Ⅱ上调Th1和Th17细胞活性的效应被氯沙坦显著抑制。

图4 不同浓度AngⅡ和不同浓度ARB刺激后效应性T细胞比例

我们得到的结果如图4 所示：与对照组比较，Ang Ⅱ刺激下Th1 细胞比例随着Ang Ⅱ浓度升高而上调，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Ang Ⅱ刺激组比较，氯沙坦预处理+ Ang Ⅱ刺激组Th1 细胞比例下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，Ang Ⅱ刺激组Th17 细胞比例随着Ang Ⅱ浓度升高而上调，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Ang Ⅱ刺激组比较，氯沙坦预处理+Ang Ⅱ刺激组Th17细胞比例下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，给予Ang Ⅱ刺激和氯沙坦预处理+Ang Ⅱ刺激Th2细胞比例均无明显变化（P＞0.05）。

3 讨论

许多研究者发现大多数心脑血管疾病的发病与动脉粥样硬化有关，而动脉粥样硬化的形成和发展与血管炎症有关，血管炎症的特征是免疫和炎症的细胞浸润明显呈高水平表达[5]。炎性反应激活了大量免疫T 淋巴细胞，导致免疫功能紊乱而形成正反馈循环，进而增强炎性反应，促进了动脉粥硬化的形成[5]。本研究中，Th1 和Th17 细胞比例的增高，以及mRNA 水平的T-bet 和RORγt 的转录因子，血浆中IFN-γ 和IL-17表达水平，这些因子在CA 组患者中相比T2DM 组患者明显增多（P＜0.05）。本研究结果证实了T细胞活性在伴有2型糖尿病的患者形成颈动脉狭窄的过程中更多的是起着关键作用。同时证实假设成立，Th1 和Th17 细胞数及其表达因子和转录因子在CA 组中较对照组和T2DM 组明显增加。这提示Th1和Th17细胞在CA 组患者颈动脉粥样硬化形成中起到促进作用。

相关研究报道[6]提到Ang Ⅱ广泛地参与动脉粥样硬化和冠心病的形成和进展。更多的证据[7]揭示出炎症事件和血管紧张素系统的相互影响很大。Ang Ⅱ诱导炎症反应和增加了免疫系统的活性，在Ang Ⅱ受体缺乏的小鼠身上，T 细胞活性被抑制。这些可能说明，伴有T2DM的CA患者形成动脉粥样硬化过程中Ang Ⅱ和T cell 活性密切相关，我们的研究也得到了相似的结论。

ARB 类药物如科素亚（氯沙坦的商品名）能够阻断血管紧张素受体（AT1），避免血管紧张素Ⅱ结合到受体上，抑制炎症细胞活性，减少细胞因子、黏附因子等的表达，从而减弱Ang Ⅱ的促炎作用，最终达到防止AS 形成的目的。近年来的研究表明[8～13]，ARB 类药物如氯沙坦、缬沙坦、替米沙坦等还有抑制Th1 为主的免疫反应、调节免疫的作用。在本组实验中，我们用氯沙坦预处理作为拮抗剂，不仅显著使Th1细胞活性下调，而且下调Th17细胞的活性，但对Th2 细胞活性无影响。这提示氯沙坦通过结合T淋巴细胞表面的AT1受体从而抑制Ang Ⅱ所诱导的效应性T 细胞的活化。所以我们得出结论：通过调整T细胞活性和其表达因子，可能促进2型糖尿病的颈动脉狭窄形成和发展。Ang Ⅱ可以调节T 细胞活性及相关因子的表达，可能会促进T2DM患者发生颈动脉粥硬化。

本研究中仍有一些局限性。首先，不同组中年龄的显著差异，归因于CA多见于老年人。年龄相一致的对照可能更恰当和更具说服力。同时，Ang Ⅱ和T 细胞活性之间的关系的潜在机制没有研究，这些需要更深一步的实验研究。

由此得出结论，Th1 和Th17 细胞比例在CA 组明显高于T2DM 组和对照组。与此一致，T-bet 、RORγt、IFN-γ和IL-17一样，其表达都是在CA组明显高于T2DM 组和对照组。因此，我们推测Ang Ⅱ可能会通过调整Th1、Th17 和相关促炎因子的表达促进伴有T2DM的颈动脉粥样硬化狭窄的形成。我们的研究可能为研究伴有T2DM的心脑血管疾病新的药物作用靶点和发病机制提供新的关注点。