支气管镜检查及肺泡灌洗液NGS 对HIV 阳性肺结核的诊断价值

刘士甫 张鑫 佘丽君 戴二黑 赵磊 王海宾★ 王立静

2019 年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）全球结核报告显示2018 年全球艾滋病病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）阳性人群中约有25.1 万人死于结核病，中国估计有1.8 万例新发HIV 相关结核［1-2］。HIV 阳性肺结核病人呈逐年递增，对人类健康造成严重危害［3］。

HIV 破坏人体免疫系统，导致被感染者更易感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB），且感染MTB 后临床症状不典型，痰菌常为阴性，影像学表现无特异性，从而导致诊断困难，延误病情，甚至危及生命［4］。支气管镜检查是一种比较安全的操作，针对各种呼吸道疾病可通过镜下观察气管、支气管、粘膜等情况，同时进行肺泡灌洗、粘膜刷检、活检等多种方法进行取材送检，该技术可明显提高肺部感染性疾病诊断率，但目前就支气管镜检查对HIV 阳性肺结核患者的诊治情况研究报道较少。

二代基因测序（Next generation sequencing，NGS）技术是利用鸟枪测序原理对标本中已经存在的所有脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）信息进行收集进而分析整个微生物组及患者标本中的人类基因组和转录组得到致病微生物的信息［5］。NGS可以作为排除包括结核在内的广泛潜在感染的重要工具。肺泡灌洗液NGS 检查在呼吸道疾病诊断中有较高的敏感性和特异性，广泛应用于临床。但在HIV 阳性肺结核的诊断检查中尚未见研究报道。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2019 年1 月至2022 年1 月本院的30 例HIV 阳性临床疑似肺结核或具有肺结核相关体征/症状的患者为研究对象，最终确诊肺结核22 例，排除肺结核8 例（肺部真菌感染、巨细胞病毒感染、肺部肿瘤、肺炎）。所有患者均行支气管镜检查，送检肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid BALF）常规检查，其中24 例患者送检BALF NGS。其临床表现主要为低热、咳嗽、食欲差、乏力，且肺部检查显示有浸润性或血行播散病灶。其中男性病人29 例，女性病人1 例，平均年龄（39.1±12.9）岁。纳入标准：研究对象均为HIV 确证实验阳性，且入院时临床疑似肺结核或具有肺结核相关体征/症状。肺结核诊断标准参照（WS288-2017）［6］。排除标准：合并心脏病、脑血管病等不能耐受气管镜检查者；标本送检项目不符合要求者；不能除外非结核杆菌感染者。本研究已获得院伦理委员会审批（编号：2021015），且均经研究对象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 实验方法

所有研究对象均使用日本Olympus 公司BF-260 型电子支气管镜进行检查，检查过程中均针对肺部病变部位进行肺泡灌洗，常规收集BALF30 mL。BALF 送检抗酸染色、快速结核菌培养、Xpert，其中24 例患者送检NGS（第2 管，BALF15mL）；均送检痰涂片抗酸染色、痰结核菌培养、痰Xpert 以及胸部CT 平扫等，诊断不明者行肺穿刺活检、淋巴结穿刺等其他检查。分析其支气管镜下表现；利用ROC 曲线评价痰、支气管镜（包括镜下直视、BALF 化验、活检病理）、痰联合支气管镜对HIV 阳性肺结核的诊断价值；利用ROC 曲线评价BALF NGS 与Xpert 检测HIV 阳性肺结核的诊断价值。检验、检查具体操作方法如下：Xpert检测：转移1 mL 痰液至试管中，再加2 mL 标本处理液，涡旋振荡后室温静置15 min，取处理后液体2 mL 加入反应盒，放于检测模块自动检测，进行核酸提取、PCR 扩增和结果的检测，2 h 后从电脑上读取MTB 检测结果；抗酸染色：依据《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》［7］的标准程序行油镜镜检；快速结核菌培养：采用比例法，在罗氏固体培养基培养，于4 周后查看菌落生长情况；NGS：标本采集到无菌管中，立即于-80℃液氮冻存，然后冷链运输至华大医学检验有限公司天津实验室进行检测。标本均在BGISEQ 一500 平台（武汉华大智造科技有限公司）上行二代测序。测序所得病原序列和病原数据库进行比对得到最终结果。以检测到结核分枝杆菌复合群唯一匹配序列为阳性，未检测到唯一匹配序列为阴性。胸部CT：采用日本飞利浦64 排128 层螺旋CT 进行扫描。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 支气管镜检查结果

淋巴结瘘3 例，新生物10 例，瘢痕、狭窄3 例，支气管炎性改变9 例，未见异常5 例，见表1。22例HIV 阳性肺结核中发现5 例支气管结核，占肺结核患者的22.73%。其中1 例于2019 年8 月9 日第1 次行支气管镜镜下表现支气管淋巴结瘘，2021年3 月22 日第2 次行气管镜支气管淋巴结瘘加重，给予镜下注药及冷冻治疗，见图A、图B、图C。其他支气管结核镜下表现可为支气管狭窄伴痰栓、支气管结核瘢痕闭锁、支气管新生物，见图D、E、F、表1。

表1 30 例研究对象支气管镜下表现［n（%）］Table 1 Bronchoscopic findings in 30 study subjects［n（%）］

2.2 BALF NGS 结果

以临床诊断为金标准，在平行送检Xpert 与NGS 的24 例标本中，17 例诊断为HIV 阳性活动性肺结核，7 例排除活动性肺结核，见表2。BALF NGS 和Xpert 诊断HIV 阳性肺结核的敏感度分别为71%、47%，特异度均为100%，ROC 曲线下的面积值为0.85、0.74。见图2、表2。

图1 HIV 阳性肺结核支气管镜下表现Figure 1 Bronchoscopic findings in HIV positive tuberculosis

图2 NGS 与Xpert 诊断HIV 阳性肺结核的ROC 曲线Figure 2 ROC curve of NGS versus xpert for the diagnosis of HIV positive tuberculosis

表2 BALF NGS 与BALF Xpert 检测结果Table 2 BALF NGS versus BALF Xpert assay results

2.3 支气管镜对HIV 阳性肺结核诊断结果

临床诊断为金标准，痰液、支气管镜、痰液联合支气管镜对HIV 阳性肺结核诊断的结果，见表3。痰液、支气管镜、痰液联合支气管镜对HIV 阳性肺结核诊断的的敏感度分别为41%、68%、86%，特异度分别为88%、100%、88%，ROC 曲线下的面积值为0.64、0.84、0.87，见图3、表3。

表3 三种诊断方法与临床诊断结果比较Table 3 Comparison of three diagnostic methods and clinical diagnostic results

3 讨论

HIV 合并MTB 的双重感染导致患者的临床表现不典型，诊断与治疗难度较大［8］。对于肺结核的诊断，推荐进行连续3 次的痰涂片和培养。HIV 感染的晚期或免疫高度抑制以及非空洞性病变时，痰菌阴性肺结核较多见［9］，所以临床仅依靠痰标本确诊HIV 阳性肺结核非常困难。

本试验中大多数患者支气管镜下异常，淋巴结瘘、瘢痕狭窄、肉芽等表现对肺结核的诊断具有重要意义。HIV 阳性肺结核患者中支气管结核占22.73%（5/22），与文献中单纯肺结核合并支气管结核发生率大致相同［10］。可见在HIV 阳性肺结核中支气管结核并不少见，由于支气管结核临床表现无特异性，以及影像学检査的局限性，支气管镜在支气管结核诊治中显得尤为重要，它不仅可以直接观察病灶，而且还能用多种方法对病灶取材，同时可镜下注药及冷冻治疗。

WHO 推荐Xpert 用作HIV 感染者结核病分子诊断的主要检测技术［11］。本研究中ROC 曲线显示NGS 的诊断价值优于Xpert。而周晛的文献提出NGS 能够较为快速地检测多类标本中的结核菌，且敏感度及特异度与Xpert 相当，可以作为确诊试验用于活动性结核病的早期辅助诊断［12］。NGS 技术是一种不使用任何引物或探针进行特异扩增，对BALF 中的核酸直接进行高通量测序，它将MTB 检测周期缩短至32～36 小时［13］。可检测10 000～20 000 种病原微生物，故NGS 可以检测新病原体。当临床表现不典型时会遗漏一些未考虑到的病原体，此时NGS 可以做出有力补充，降低漏诊率［14-15］。还可通过NGS 技术早期诊断非结核分枝杆菌感染，从而对非结核分枝杆菌肺病进行有效的诊断和鉴别诊断［16］。有文献表明NGS 检测对肺组织标本敏感度最高，其次为BALF，但在痰标本中与传统培养相比差异没有统计学意义［14］。综上所述，BALF NGS 技术具有检测效能高，检测时间短，同时覆盖结核分枝杆菌及其他多种病原微生物的特点，对于HIV阳性肺结核的诊断较其它诊断方法更有前景。

本研究显示支气管镜检查（包括BALF 送检细菌学、分子生物学及活检病理）诊断HIV 阳性肺结核的敏感度、特异度明显高于痰标本方法，诊断效能显著提高。文献报道对临床表现和影像学怀疑肺结核而痰菌阴性的患者支气管镜综合技术诊断肺结核的灵敏度、特异度分别为91.01%、97.46%，具有良好的临床价值，可作为常规检查加以推广［17］。而本研究显示支气管镜检查是明确诊断HIV 阳性肺结核的有力工具，与痰标本联合送检可显著提升HIV 感染者肺结核的诊断率。因此对于诊断不明确、进展较快、抗普通菌治疗效果差、病变吸收欠佳但不能除外肺结核的HIV 阳性患者，在送检痰标本的同时应尽早行支气管镜检查，并采样送检相关病原学及病理，有助于临床的正确诊断或病原学诊断。