分光光度法测定荞麦粉中总黄酮含量的不确定度评定

雒晓玲

（山西省检验检测中心（山西省标准计量技术研究院），山西太原 030012）

荞麦中总黄酮含量的测定是衡量荞麦质量的重要指标之一[1]。分光光度法作为食品检验检测机构测定荞麦及其制品中总黄酮含量的常规方法，对其进行不确定度评定，分析影响检测结果的主要因素十分必要[2]。本研究参照《荞麦及其制品中总黄酮含量的测定》（NY/T 1295—2007）[3]测定荞麦粉中总黄酮含量（以芦丁为对照品），依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[4]中规定的方法程序对其不确定度进行分析和评定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荞麦粉（500 g/袋），购自某粮油商店；芦丁标准品（纯度99.0%），坛墨质检-标准物质中心；三氯化铝（分析纯），上海埃彼化学试剂有限公司；乙酸钾（分析纯），宜兴阿拉丁化工贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

721G 可见分光光度计，上海仪电控股（集团）公司；AL104 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SHA-B 恒温水浴振荡器，常州金坛恒丰仪器制造有限公司等。

1.3 测定方法步骤

1.3.1 标准曲线绘制

（1）标准储备液配制。准确称取0.050 0 g 芦丁标准品于100 mL 烧杯中，加入甲醇水溶液（7+3）溶解，转移入1 000 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（7+3）稀释并定容，配制成0.050 0 mg·mL-1的芦丁标准储备液。

（2）工 作 曲 线 绘 制。 准 确 吸 取0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL 和4.00 mL 芦丁标准储备液于10 mL 容量瓶，分别加入2 mL 三氯化铝（0.1 mol·L-1）溶液、3 mL 乙酸钾（1 mol·L-1）溶液，加入甲醇并定容至刻度，配制成芦丁浓度分别为0 0..0 01 001 0 205 mmgg··mmLL--11、、00.0.0 1 0520500mmg·gm·mLL-1-1和、00..002005 0000 mmgg··mmLL--11、的标准工作系列。室温下放置0.5 h 后，使用分光光度计在波长λ=420 nm 处测定吸光度，以标准系列浓度值为横坐标，测得吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 试样溶液制备

准确称取0.400 0 （g精确至0.000 1 g）荞麦粉试样置于具塞三角瓶中，加入30 mL 甲醇水溶液（7+3），盖紧瓶塞后放入65 ℃的恒温水浴振荡器中以160 r·min-1的频率振摇2 h，趁热过滤至50 mL 容量瓶中，再用甲醇水溶液（7+3）洗涤滤纸与残渣，将滤液并入容量瓶中，并用甲醇水溶液（7+3）定容，摇匀后待测。

1.3.3 待测试液测定

准确吸取1.0 mL 待测试液于10 mL 容量瓶中，分别加入2 mL 三氯化铝（0.1 mol·L-1）溶液、3 mL 乙酸钾（1 mol·L-1）溶液，加入甲醇并定容至刻度，摇匀，室温下放置0.5 h，置于4 000 r·min-1的离心机中离心10 min，使用分光光度计在波长λ=420 nm 处测得吸光值，计算得待测试液中的总黄酮浓度。

2 结果与分析

2.1 不确定度分析

2.1.1 数学模型建立

荞麦粉中总黄酮含量的计算公式为

式中：w为荞麦粉中总黄酮含量，g/100 g；C为待测试液中总黄酮浓度，mg·mL-1；V为待测试液体积，mL；D为试样总稀释倍数，D=500；H为试样水分的质量分数，测得H=12.40；m为称样量，g。

2.1.2 不确定度来源

结合方法测定步骤和建立的数学模型，可确定该试验过程中可能引入的不确定度来源：标准溶液配制引入的不确定度（包括标准品赋值、标准储备液及标准系列配制）；试样溶液制备及测定引入的不确定度（包括试样称量、试液移取及定容等）；标准曲线拟合引入的不确定度及重复测定引入的不确定度。

2.2 不确定度分量评定

2.2.1 标准溶液配制引入的不确定度分量urel(c)

（1）标准品赋值。芦丁标准品的编号为710100-100 mg，批号为23040089，标准品证书中的相对扩展不确定度为U=kurel(p)=0.008（k=2），由此其产生的相对不确定度为urel(p)=0.004。

（2）标准储备液配制过程。称取0.050 0 g 芦丁标准品使用AL104 电子天平，由检定证书上得到其线性允差为0.1 mg，假设为三角分布，故标准不确定度为g，相对不确定度为。定容使用1 000 mL 单标线容量瓶（A 级），根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG196—2006）[5]，20 ℃时实验中所用各种A级玻璃量器的不确定度分量按矩形分布，取。假设实验温差为±5℃，水膨胀系数为2.10×10-4/℃，温差变化引入的不确定度按照矩形分布计算，取，结果见表1。标准储备液配制产生的相对不确定度分量为。

表1 玻璃量器引入的相对不确定度

（3）标 准 系 列 配 制 过 程。 吸 取0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL 芦丁标准储备液使用1 mL 分度吸量管（A 级），吸取2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL 芦丁标准储备液使用5 mL 分度吸量管（A 级），定容使用10 mL 单标线容量瓶（A 级）。玻璃量器各自引入的相对不确定度见表1，其中，，。为避免重复评定，多次使用的玻璃量器只计算1 次，标准系列配制产生的相对不确定度分量为

2.2.2 试液制备及测定引入的不确定度分量urel(x)

（1）试样溶液制备过程。称取0.400 0 g 荞麦粉试样使用AL104 电子天平，其线性允差为0.1 mg，假设为三角分布，标准不确定度为， 相对不确定度为。定容使用50 mL 单标线容量瓶（A 级），各自引入的相对不确定度见表1，该过程产生的相对不确定度分量为

（2）待测试液测定过程。吸取1.0 mL 待测试液使用1 mL 分度吸量管（A 级），定容使用10 mL 单标线容量瓶（A 级），各自引入的相对不确定度见表1，该过程产生的相对不确定度分量为

由此，试液制备测定过程产生的不确定度分量

2.2.3 标准曲线拟合引入的不确定度分量urel(q)

将配制的芦丁标准系列溶液重复测定3 次，检测数据统计于表2，用最小二乘法拟合线性回归方程，芦丁质量浓度在0.001 25 ～0.020 00 mg·mL-1时，I=35.956C+0.006 1，b=35.956，a=0.006 1。该过程产生的标准不确定度计算公式为

式中：n为标准系列测定次数，n=18；P为荞麦粉试样测定次数，P=6。荞麦粉试样中总黄酮测定平均值为0.33 g/100 g，代入2.1.1 数学模型中，计算得C=0.00231 mg·mL-1，标准系列溶液平均浓度为，，，SR=0.00883。由此可得，u(q)=0.000152，相对标准不确定度为urel(q)=。

2.2.4 重复测定引入的不确定度分量urel(s)

将购自某粮油商店的荞麦粉试样在期间精密度条件下（重复测定6 次，结果分别为0.32 g/100 g、0.33 g/100 g、0.32 g/100 g、0.34 g/100 g、0.32 g/100 g 和0.35 g/100g，测定平均值为0.33 g/100 g，标准偏差s为0.012 65。该过程的标准不确定度为，产生的相对标准不确定度分量。

2.3 合成不确定度和扩展不确定度评定

2.3.1 合成不确定度

按方和根公式计算得

2.3.2 扩展不确定度

取包含因子k=2，近似95%置信概率，总黄酮含量的测量扩展不确定度U=ku=0.02 g/100 g。

2.4 测量不确定度结果

分光光度法测定荞麦粉中总黄酮含量的测量不确定度结果为（0.33±0.02）g/100 g，k=2，P=95%。

3 结论

通过对分光光度法测定荞麦粉中总黄酮含量的不确定度分析评定与计算合成，试验过程中产生不确定度各分量的影响顺序大小为标准曲线拟合＞重复测定＞标准溶液配制＞试样制备检测。可见在理化项目检验中人为操作因素对实验结果的影响较大，食品检验检测机构应加强对一线检验人员的专业培训，从事理化检验项目的人员也需重视基础操作技能水平的提升，以提高检验检测结果的准确性。