消毒酒精的贮存条件和消毒效果研究

林淑仪，杨爱君，何 瑛，梁俊健，林木娣，黄浩杰

（广东燕塘乳业股份有限公司，广东广州 510700）

75%酒精是一种广泛使用的常规消毒剂[1]，具有很强的渗透能力，可穿透细胞膜，进入细菌内部，凝固蛋白质，从而起到杀菌的作用。酒精浓度过高或过低都会对杀菌消毒效果产生影响，酒精浓度越高，脱水能力越强，使蛋白质凝固的作用也就越强。当过高浓度的酒精与细菌接触时，菌体表面会迅速凝固，形成一层包膜，阻止酒精继续向菌体内部渗透，导致细菌不能被彻底杀死。如果浓度太低，酒精含水量太高，单位体积内乙醇分子含量太少，虽然可以渗透进入细菌内部，但不能将其体内的蛋白质凝固，不足以彻底杀灭细菌。综合以上两点，兼顾杀菌消毒能力和渗透性，70%～75%的酒精可以使菌体蛋白质脱水、变性、沉淀，不会使菌体形成包膜，而且酒精可以不断地深入菌体内部，作用于菌体内所有的蛋白质，最后杀死细菌，杀菌比较彻底。

食品加工企业通常直接购买75%食品级酒精或用95%的食用酒精稀释成75%酒精作消毒剂使用，75%的酒精穿透能力、作用速度最佳，但酒精具有挥发性，在使用一段时间后，酒精的消毒作用就会减弱，贮存环境的温度直接影响酒精的挥发速度，对酒精的“有效期”影响明显[2-4]。本文将75%酒精分别放在6 ℃、25 ℃和35 ℃的环境中存放30 d，模拟冬天室内工作间、恒温洁净车间和夏天室内工作间的工作场所温度，观察75%酒精浓度的挥发速度和消毒效果的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验微生物以金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表，广州环凯微生物科技有限公司；大肠杆菌（ATCC 25922）作为细菌繁殖体中肠道菌的代表，广州环凯微生物科技有限公司；95%的食用酒精，广西金源生化集团；缓冲蛋白胨水培养基、营养琼脂、结晶紫中性红胆盐培养基，北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

温度测量仪，德图仪器国际贸易（上海）有限公司；电热恒温培养箱，上海延翌仪器仪表有限公司；酒精计（量程在0%～100%）。

1.3 试验方法

1.3.1 75%酒精的配制与贮存

采用公式法计算

式中：A为95%酒精的总体积；B为75%酒精的总体积。所需添加纯水的量C=B-A。

本试验配制5 L 75%的酒精，根据上述的计算公式得出，需量取3 947 mL 95%酒精于5 L 的容器中，往容器中加入1 053 mL 纯水，搅拌均匀，静置，从中倒出220 mL 液体至量筒，用酒精计和温度测量仪测出酒精浓度和温度，经换算其酒精浓度为75.4%。用1 L的PP 锥形瓶盛装，分别放置在6 ℃、25 ℃和35 ℃环境下贮存30 d，每日早晚各开启一次，每次5 min，目的是模拟企业日常每天开启容器领取75%酒精的时间。

1.3.2 酒精浓度的检测

每日取220 mL 酒精置于洁净、干燥的250 mL量筒内，静置数分钟，待酒精中的气泡完全消失后，放入洁净、擦干的酒精计，不接触量筒壁，平衡时间5 min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度数值，同时用温度测量仪测定此时酒精的温度。根据测得的酒精示值和温度通过《酒精水溶液密度与酒精度（乙醇含量）对照表（20 ℃）》换算成20 ℃时的酒精度。同时，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值，不应超过平均值的0.5%[5]。

1.3.3 消毒效果试验

①菌液制备。使用已传至3 代的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌株接种于缓冲蛋白胨水培养基中，于36 ℃电热恒温培养箱中培养24 h，培养后菌液浓度应不少于1×105CFU·mL-1。②设置“6 ℃贮存条件”“25 ℃贮存条件”和“35 ℃贮存条件”共3 个组，每组3 个无菌离心管，然后分别往每个无菌离心管中加入1 mL 菌液和9 mL75%酒精溶液（阳性对照管用缓冲蛋白胨水替代75%酒精），振荡均匀，分别作用0.5 min、1.0 min 和2.0 min 后，向 混 合 液 中 加 入10 mL 营养肉汤，10 min 后，取其中1 mL 混匀溶液进行平板倾注，在36 ℃的电热恒温培养箱中培养48 h。③根据《消毒技术规范》（2002 年版），计算活菌浓度（CFU·mL-1），换算成对数值，然后计算杀灭对数值：杀灭对数值＝阳性对照组平均活菌浓度的对数值－实验组活菌浓度的对数值。判定标准：对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀灭对数值均≥5.00，判为消毒合格[6]。

2 结果与分析

2.1 不同环境温度贮存下75%酒精浓度变化检测结果

75%酒精配制后，在PP 锥形瓶容器贮存下，其酒精浓度在6 ℃、25 ℃和35 ℃的趋势变化见图1。6 ℃、25 ℃和35 ℃环境贮存下，酒精浓度分别从75.4%下降至74.5%、73.3%和71.2%。总的来说，贮存环境温度越高，酒精的挥发性越强，酒精浓度下降速度越快。虽然75%酒精在不同贮存温度环境下挥发速度有所不同，但在一个月的贮存期内，酒精浓度仍在70%以上，可以达到酒精作为消毒剂的限值标准要求[7]。

图1 酒精浓度趋势变化

2.2 不同贮存温度下75%酒精的消毒效果对比

75%酒精配制后分别在6 ℃、25 ℃和35 ℃环境下贮存30 d，在贮存期间分别选择贮存时长0 d、7 d、9 d、15 d、20 d 和30 d 的6 个时间段对75%酒精的消毒效果进行对比。在30 d 贮存期内，75%酒精作用0.5 min、1.0 min 和2.0 min 都可以达到对金黄色葡萄球菌的消毒效果。其中贮存时长为30 d 时，作用0.5 min 后有金黄色葡萄球菌生长，但作用1.0 min和2.0 min 可以100%杀灭金黄色葡萄球菌，平均杀灭对数值为8.41（见表1、表2、表3）。

表1 6 ℃贮存下75%酒精不同消毒作用时间的消毒效果

表2 25 ℃贮存下75%酒精不同消毒作用时间的消毒效果

表3 35 ℃贮存下75%酒精不同消毒作用时间的消毒效果

75%酒精对大肠杆菌的消毒效果随着贮存时间的延长逐渐降低，其中2.0 min 的消毒效果最好，可以达到100%的杀灭率，作用1.0 min 和0.5 min 的消毒效果逐渐降低，但其6 个贮存时长的平均杀灭对数值均≥5.00，达到规定的消毒合格要求。

3 结论与讨论

研究75%酒精在不同环境温度中贮存30 d 的过程中，其酒精浓度和消毒效果的变化。结果表明，75%酒精分别在6 ℃、25 ℃和35 ℃ 3 个温度中贮存30 d 后酒精浓度仍可以达到70%以上；在相同的贮存时间内，环境温度的高低会直接影响酒精浓度挥发性的速度，温度越高，酒精挥发速度越快。在30 d 贮存期间，选择6 个不同贮存时长的75%酒精对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作用0.5 min、1.0 min 和2.0 min，其平均对数值均可以达到5.00 以上，对细菌的杀灭效果可以达到规定的消毒要求。同时，在3 个不同的贮存温度环境中，75%酒精在每日开启10 min 情况下，贮存0 d 和30 d 对金黄色葡萄球菌作用1.0 min 和2.0 min 的灭菌作用没有差别，但贮存30 d 对金黄色葡萄球菌作用0.5 min 后，有金黄色葡萄球菌生长。可见，75%酒精在6 ℃、和35 ℃环境中贮存30 d，仍具有较强的消毒作用，企业可以根据自身需求选择不同的贮存时长和消毒作用时间。

通过对75%酒精的贮存温度和消毒效果的试验检测，建议75%消毒酒精在30 d 的保存期中，存储温度≤25 ℃，消毒时间≥1.0 min，既可减少配制的次数，又可以保证消毒效果。