7种不同灭菌方法对白芍药材中有效成分的影响

刘 青，汪 泓

（济南市中医医院 药剂科，山东 济南 250012）

白芍为毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根，具有抗炎、镇痛、保肝、抗抑郁、调节免疫等药理作用[1-3]，含挥发油类、单萜类、三萜类及黄酮类等多种化合物，研究表明[4-8]，没食子酸、儿茶素、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、1,2, 3, 4, 6-O-五没食子酰葡萄糖等成分在受到高温、高湿、光照等条件的影响时，易发生降解反应。

中药材主要来源于植物、动物及矿物质等，其本身常带有一定微生物，且加工炮制过程中也会引入微生物，部分微生物生长繁殖对中药材质量有一定影响，甚至危及患者健康和生命安全。因此，对中药材出厂前进行灭菌处理及控制具有十分重要的意义[9]。在实际生产中，需根据目标药材和制剂的特点和内含化合物的稳定性选择恰当的灭菌方式，既要达到灭菌效果又要保证有效成分不受破坏，且采用的灭菌方式应经过方法学验证。目前，中药材的灭菌方法主要有干热灭菌法、湿热灭菌法、流通蒸汽灭菌法、环氧乙烷灭菌法、微波灭菌法、60Co-γ射线辐照灭菌等多种方法，部分药材在灭菌过程中药材质量存在不同程度改变[10]。

本研究分别采用干热灭菌、湿热蒸汽灭菌、流通蒸汽灭菌、紫外灭菌、臭氧灭菌、微波灭菌、60Co-γ射线辐照灭菌法，对白芍药材进行灭菌处理，考察6种有效成分：没食子酸、儿茶素、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷和1, 2, 3, 4, 6-O-五没食子酰葡萄糖的含量变化规律和灭菌效果，为选择和提供白芍药材灭菌工艺及质控方法提供参考依据。

1 仪器和材料

2695型高效液相色谱仪（2996DAD检测器，美国沃特世公司）；LS-50LD型立式蒸汽压力灭菌器（常州杰博森仪器有限公司）；FW200型万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；臭氧消毒机（上海书培实验设备有限公司）；VDM50型真空干燥箱（德国爱安姆科技有限公司）；FA2004型电子分析天平（上海衡平仪器仪表有限公司）；KQ-250A型超声波清洗器（北京科伟永兴仪器有限公司）；BXH-130型电热鼓风干燥箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；YJ-875 型医用净化工作台（苏州净化设备厂）。

芍药药材采自安徽亳州华佗镇，采收时间为2019年06月15日，经鉴定为毛莨科植物芍药PaeonialactifloraPall.的去皮干燥根。没食子酸对照品（批号：110831-201906，供含量测定用）、儿茶素对照品（批号：110877-201604，供含量测定用）、芍药苷对照品（批号：110736-201943，供含量测定用）均来源于中国食品药品检定研究院，芍药内酯苷对照品（批号：A25D8H50784，纯度≥91.4 %）、苯甲酰芍药苷对照品（批号：MUST-19022310，纯度≥98.0 %）、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖对照品（批号P29F7F10218，纯度≥99.0 %）购自上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 白芍药材灭菌处理

取白芍药材适量，洗净，润透，切薄片，干燥，分别按下列方法灭菌处理。

2.1.1 干热灭菌 取白芍药材饮片适量，于180 ℃干热灭菌1 h，置洁净室内冷却至室温，置入灭菌袋中备用。

2.1.2 湿热蒸汽灭菌 取白芍药材饮片适量，在121 ℃下灭菌10 min，置洁净室内冷却至室温，置入灭菌袋中备用。

2.1.3 流通蒸汽灭菌 取白芍药材饮片适量，置放流通蒸汽灭菌柜内，通入蒸汽，待温度上升至110 ℃、内压0.1 MPa时，灭菌30 min，待压力降为零时取出，置洁净室内冷却备用，置入灭菌袋中备用。

2.1.4 紫外灭菌 取白芍药材饮片适量，紫外灯下照射2 h，置洁净室内冷却至室温，置入灭菌袋中备用。

2.1.5 臭氧灭菌 取白芍药材饮片适量，臭氧灭菌样品浓度为20 g/m³，灭菌60 min，置洁净室内冷却至室温，置入灭菌袋中备用。

2.1.6 微波灭菌 取白芍药材饮片适量，频率2500 MHz，灭菌6 min，置洁净室内冷却至室温，置入灭菌袋中备用。

2.1.760Co-γ射线辐照灭菌 取白芍药材饮片适量，调节辐照剂量为5 kGy，60Co-γ射线辐照灭菌1 h，置洁净室内冷却至室温，置入灭菌袋中备用。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 取没食子酸、儿茶素、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、1, 2, 3, 4, 6-O-五没食子酰葡萄糖对照品各适量，加甲醇制成含上述成分浓度分别为0.051，0.056，1.550，0.058，0.214和0.126 mg/ml的混合对照品贮备液；精密量取上述溶液1 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取未灭菌及按2.1项下灭菌处理后的白芍饮片各适量，粉碎，取药材粗粉约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加稀乙醇60 ml，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz) 60 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件[11]

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A为乙腈，B为0.05 %磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，5 %→8 % A；10～20 min，8 % A→35 % A；20～30 min，35 % A；30～45 min，35 % A→55 % A；45～65 min，55 % A；65～70 min，55 % A→5 % A）；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl。

图1 白芍高效液相色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取混合对照品贮备液，分别精密取0.2，0.4，0.8，1.2，2.4，3.6，4.8 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，按2.3项下色谱条件测定，记录色谱图峰面积，以峰面积（Y）对6种成分质量浓度（X，μg/ml）进行线性回归，绘制标准曲线，计算线性范围方程及r值，线性关系考察结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.4.2 精密度试验 取混合对照品溶液，按2.3项色谱条件，连续进样6次，记录色谱图峰面积，测得没食子酸、儿茶素、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、1, 2, 3, 4, 6-O-五没食子酰葡萄糖峰面积RSD分别为0.20 %，0.18 %，0.04 %，0.14 %，0.32%和0.45 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取未灭菌白芍饮片6份，按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.3项色谱条件测定，记录色谱图峰面积，计算各成分含量和RSD。结果没食子酸、儿茶素、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、1, 2, 3, 4, 6-O-五没食子酰葡萄糖平均含量分别为1.665，1.453，35.625，1.230，6.145，3.806 mg/g，RSD分别为0.56 %，0.68 %，0.45 %，0.78 %，1.02 %和1.35 %（n=6），表明方法重复性较好。

2.4.4 稳定性试验 取未灭菌白芍饮片，按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.3项色谱条件测定，分别于0，3，6，9，12，18，24 h进样，记录色谱图峰面积。结果没食子酸、儿茶素、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、1, 2, 3, 4, 6-O-五没食子酰葡萄糖峰面积RSD分别为0.86 %，0.75 %，0.58 %，0.95 %，1.32 %和1.55 %（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验 取未灭菌的白芍饮片6份，粉碎，精密称取粗粉0.15 g，置具塞锥形瓶中，加入2.2项下混合对照品贮备液3.5 ml，加稀乙醇60 ml，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）60 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在2.3项色谱条件下进行测定，记录色谱图峰面积，计算白芍药材中6种成分加样回收率，结果见表2。

表2 白芍药材6种成分加样回收率试验结果（n=6）

2.4.6 样品测定 取未灭菌、干热灭菌、湿热蒸汽灭菌、流通蒸汽灭菌、紫外灭菌、臭氧灭菌、微波灭菌、60Co-γ射线辐照灭菌处理的白芍饮片适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件测定，记录色谱图峰面积，按标准曲线法计算白芍药材中6种成分的含量，并绘制各成分在不同灭菌方式下含量变化折线趋势图，含量数据结果见表3、含量变化趋势图见图2。

表3 白芍药材中6种成分含量测定结果/mg·g-1（n=3）

图2 不同灭菌方式对白芍药材有效成分含量影响趋势图

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

利用DAD检测器功能，对供试品色谱图中没食子酸、儿茶素、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖的色谱图进行光谱解析，各成分光谱最大吸收位置存在差异，但在230 nm处吸收值均较强，所以设定230 nm为检测波长。本研究先后考察乙腈-0.1 mol/L磷酸盐缓冲液、乙腈-0.1 %冰醋酸水溶液、甲醇-0.05 %磷酸水溶液和乙腈-0.05 %磷酸水溶液流动相系统，结果以乙腈-0.05 %磷酸水溶液为流动相时，6个主成分色谱峰分离度、对称性更好，所以选取此系统为流动相。在以上色谱条件下，分别考察Agilent Zorbax SB-C18、Inertsil®ODS-2、Phenomenex Kinetex C18及Agilent ZORBAX SB-Aq C184种品牌色谱柱，结果以Agilent ZORBAX SB-Aq C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱的分离效果最佳。

3.2 提取方式的优化

为考察白芍药材最佳提取条件，在查阅文献[12-14]及单因素试验条件下，本研究以A-料液比、B-乙醇浓度、C-提取时间为考察因素，6种成分含量数据经标准化处理后的综合评分为评价指标，设计三因素三水平正交试验，对白芍药材提取条件进行优化，正交设计与方差分析结果见表4～5。

表4 L9(34)正交试验设计及结果分析

表5 影响白芍药材有效成分提取因素方差分析表

由表4可见，A3B2C2为最佳提取条件，方差分析结果表明，药材粉末料液比（A）对评价指标有显著性影响（P＜0.05），是影响药材中6种成分溶出的主要影响因素。实验结合环保、经济等实际情况，综合得出本实验的最优提取条件为：以200倍稀乙醇超声提取60 min，在此条件下，取3批未灭菌的药材进行试验，测得各成分含量值较高，3批含量偏差均小于0.5，表明正交试验优化条件准确、试验和可靠，可作为本研究的提取条件。

3.3 灭菌效果检查

取未灭菌、干热灭菌、湿热蒸汽灭菌、流通蒸汽灭菌、紫外灭菌、臭氧灭菌、微波灭菌、60Co-γ射线辐照灭菌处理的白芍饮片适量，按中国药典2020年版四部（1105）非无菌产品微生物限度微生物计数法检查[15]，结果见表6。结果表明，不同的灭菌方式处理后的样品均符合中国药典要求（即需氧菌不得过105cfu/g，霉菌和酵母菌总数不多过103cfu/g），与其它灭菌方式比较，紫外灭菌和臭氧灭菌较效果较差，湿热灭菌和辐照灭菌效果最好。

表6 白芍药材微生物限度检查结果

3.4 不同灭菌方式对白芍质量影响

由表2和图2可见，不同的灭菌方式对白芍药材中6种成分含量均有不同程度影响。其中，干热灭菌对儿茶素和没食子酸的影响最大，可能此二种成分受高温易降解；其次，臭氧灭菌对芍药苷内酯、芍药苷及1, 2, 3, 4, 6-O-五没食子酰葡萄糖也有较大影响，这与文献报道[6-8]结果相符，上述成分在高温、高湿条件下易降解；7种灭菌方式中，对含量影响较小为微波灭菌和辐照灭菌。其中，辐照灭菌对白芍药材有效成分的影响可忽略不计，与未灭菌含量数据比较，辐照灭菌处理后药材中芍药苷、儿茶素、没食子酸、1, 2, 3, 4, 6-O-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷含量偏差分别为：0.01 %，0.17 %，0.03 %，0.20 %，0.01 %，0.08 %，所以60Co-γ射线辐照灭菌可作为白芍药材出厂前的有效灭菌处理方式。

通过对干热灭菌、湿热蒸汽灭菌、流通蒸汽灭菌、紫外灭菌、臭氧灭菌、微波灭菌、60Co-γ射线辐照灭菌等7种方式对白芍药材中6种成分的影响及微生物限度测定，发现白芍药材最为理想灭菌方式为60Co-γ射线辐照灭菌，此条件下，没食子酸、儿茶素、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、1, 2, 3, 4, 6-O-五没食子酰葡萄糖含量稳定，灭菌后微生物存活率最低，可保证药材在流动和使用环节的微生物限度在许可范围内，可作为白芍药材的一种有效灭菌手段加以推广和应用。