玉米和玉米淀粉对断奶仔猪肠道屏障的影响

黎 梦,王 奕,何家建,魏立民,陈 婷,习欠云,孙加节,张 瑾,张永亮*

(1.嘉兴学院 生物与化学工程学院,浙江 嘉兴 314000;2.华南农业大学 动物科学学院,广东 广州 510642;3.海南省农业科学院 畜牧兽医研究所,海南 海口 571100)

肠道作为机体代谢和更新最旺盛的组织,提供物理隔离、营养吸收和肠道屏障的作用,更是内外环境信号转导枢纽,对维持仔猪的健康生长具有重要作用。其黏膜结构受损、功能紊乱和生态失调均会影响肠道的健康。在畜牧业中,早期断奶应激往往会造成仔猪肠道屏障损伤,进而导致肠道消化吸收功能障碍、免疫功能异常、菌群失调,易引起仔猪腹泻、生长受阻以及影响仔猪存活率[1],这也是目前我国仔猪生产中存在的主要问题。仔猪阶段的死亡淘汰率占整个养猪过程的75%,给养猪业造成巨大的经济损失(国家统计局)。因此,保证肠道健康,是保障仔猪生长和提高仔猪存活率的关键,有利于提高畜牧生产水平。

现代养猪生产中早已关注仔猪断奶早期给养猪业带来的影响,并推广仔猪早期断奶技术。由于受心理、环境和营养应激等因素影响,早期断奶仔猪仍易产生腹泻,影响仔猪的存活率和生长性能[2]。FUNDERBURKE等[3]曾研究断奶仔猪在这3种应激下的生理和生长,发现其中饲料营养应激的影响最大,故早期断奶仔猪饲料的配制至关重要,关系到断奶仔猪生长及后期生产性能的发挥。近年来,关于断奶仔猪饲料营养素调控的研究主要集中在能量[4]、蛋白质[5]、微量元素[6]以及维生素[7]等方面。此外,饲料形态[8]、纤维含量[9]、以及饲料中淀粉类型[10]、淀粉糊化程度也会影响断奶仔猪对营养物质的消化和健康。可见饲料影响断奶仔猪生长的因素很多,因此探索饲料中影响断奶仔猪肠道健康及生长性能尤为重要。

本研究将玉米和玉米淀粉配制营养和能量均衡的饲料,分别饲喂断奶仔猪,探究不同原料对断奶仔猪肠道屏障的影响,在分子水平揭示其对仔猪肠道屏障的影响及其机制,并分析原因。

1 材料与方法

1.1 试验设计及饲料选取72只28日龄断奶的大白猪随机分为2组,将玉米饲料饲喂的断奶仔猪设为玉米组,断奶仔猪饲料中的玉米替换为同种玉米淀粉制备成淀粉饲料,并平衡2种饲料的营养水平和能量,玉米淀粉饲料进行饲喂设为淀粉组。每组2个重复(雌、雄各1/2),每个重复18只,分4栏饲养,预饲7 d,正式试验周期21 d,选择湿法和自由采食进行饲喂。饲料组成及营养水平见表1。

1.2 测定指标及方法

表1 饲料组成及营养水平(干物质基础) %

1.2.2血清生化指标 测定在试验结束时,随机取每组6只仔猪分别采集全血,室温倾斜静止1 h,室温条件下4 000 r/min离心10 min获取血清,-20℃ 保存。用AU5800全自动生化分析仪(美国贝克曼)及中生北控试剂盒测定血清中总蛋白(TP,双缩脲法)、白蛋白(ALB,溴甲酚绿法)、球蛋白(GLB,溴甲酚绿法)含量及谷丙转氨酶(ALT,IFCC法)、谷草转氨酶(AST,氧化酶法)的活性,以及总胆固醇(TC,氧化酶法)、甘油三酯(TG,酶法)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C,酶法)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C,酶法)含量。

1.2.3消化道pH值的测定 试验结束后颈动脉放血处死并迅速打开腹腔,纵向剖开肠道,收集内容物至平皿中混匀,吸取少量上清液检测pH值。

1.2.4HE染色 取新鲜的十二指肠组织固定在10%的中性缓冲甲醛中,用石蜡进行包埋,并将石蜡切成厚度为6 mm的水平切片,用标准的苏木精和伊红对切片进行染色。在显微镜(尼康)下以100和200倍放大观察绒毛结构。

1.2.5实时荧光定量PCR (qRT-PCR)纵向剖开肠道,冲净残余内容物,用破片小心刮取十二指肠黏膜,收集1 mL获取肠道黏膜组织于液氮保存。利用TRIzol(15596018,Thermo Fisher)裂解法提取动物RNA。参照TaKaRa反转录试剂盒(RRO-47A)说明书进行反转录,采用qRT-PCR方法检测肠黏膜尾型同源盒基因(CDX2)、增殖细胞核抗原(PCNA)、闭锁蛋白(OCLN)、闭合蛋白(CLDN1)、黏蛋白(MUC2)和肿瘤坏死因子(TNFα)、Wnt家族成员10b(Wnt10b)、β-连环蛋白(β-catenin)、原癌基因(C-myc)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和β肌动蛋白(β-actin)mRNA相对表达量,在实时荧光定量PCR仪(stratagene mx3005p,Agilent)中进行热循环反应,反应程序为:95℃ 2 min预变性;95℃ 15 s 变性,15 s退火,72℃ 40 s延伸,反应40个循环;最后95℃ 1 min,30 s退火,95℃ 30 s,绘制相应的熔解曲线,反应设立无模板反转录样品为阴性对照(NTC)。以β-actin为内参基因,按照2-△△Ct法计算各基因mRNA相对表达量,引物信息见表2。

表2 qRT-PCR特异性引物

1.2.6Western blot检测 蛋白含量使用含有1 mmol/L PMSF的RIPA缓冲液裂解肠道黏膜提取TP,并通过BCATP检测试剂盒(Thermo Fisher,Waltham,美国)进行定量。蛋白质悬浮液(20 μg)用蛋白上样缓冲液稀释并煮沸10 min。然后用5%和10%的SDS-PAGE对蛋白样品进行解析,并转移到PVDF膜上。Wnt10b、β-catenin、Cyclin D1、C-myc和PCNA蛋白的检测一抗分别使用兔源的anti-human Wnt10b(1∶500,D162612,上海生工,中国)、anti-human β-catenin(1∶500,D260137,上海生工,中国)、anti-human Cyclin D1(1∶2 000,2922,Cell Signalling Technology,美国)和anti-human C-MYC(1∶1 000,D199941,上海生工,中国),然后用辣根过氧化物酶标记的兔源IgG二抗(1∶50 000,BS10002/3,Bioworld Technology,美国)。β-actin(1∶5 000,BS6007M,Bioworld Technology,美国)作为内参。用Image J测量条带灰度,并将用β-actin作为内参计算相对蛋白灰度。

1.3 统计与分析本试验2组间比较采用独立样本t检验(t-test)进行统计分析,使用GraphPad 6.0制图,以P<0.05为显著性标准,P<0.01为极显著标准。

2 结果

2.1 玉米和玉米淀粉对断奶仔猪生长性能的影响与玉米组相比,淀粉组仔猪体质量增重在第10天显著受到抑制(P<0.05),试验结束时差异极显著(图1A,P<0.01),平均日增质量极显著下调(图1B,P<0.01);淀粉组仔猪的平均日采食量减少,随着饲喂时间的增加减少幅度增大(图1C)。结果表明,玉米淀粉饲料抑制仔猪的采食量和增质量。

A.仔猪体质量;B.仔猪平均日增质量;C.仔猪平均日采食量;*.P<0.05,**.P<0.01。下同

2.2 玉米和玉米淀粉对仔猪血液生化指标的影响如图2～4所示,与玉米组相比,淀粉组血清ALB和TP含量及AST、γ-GT和LDH活性显著下降(P<0.05),提示淀粉组仔猪肝脏功能和蛋白质等代谢活动下降;淀粉组仔猪血清HDL-C和TC含量极显著下降(P<0.01),TG含量显著下降(P<0.05),即玉米淀粉饲料抑制仔猪血脂水平。这些结果提示玉米淀粉饲料可能抑制机体代谢。

2.3 玉米和玉米淀粉对肠道pH值绒毛的影响检测胃肠消化道的酸碱环境,如图5A所示,与玉米组相比,淀粉组十二指肠pH值极显著增加(P<0.01),胃、空肠、回肠、盲肠和结肠pH值都维持正常的生理水平。同时通过十二指肠的肠道切片观察肠道的绒毛形态,结果显示,相对于玉米组,淀粉组的肠道绒毛密度与细胞细胞密度明显减少(图5B)。

A.仔猪血清TP含量;B.仔猪血清ALB含量;C.仔猪血清GLB含量;D.仔猪血清ALB和TP比值

A.仔猪血清谷ALT活性;B.仔猪血清AST活性;C.仔猪血清谷ALT活性和AST活性比值;D.仔猪血清γ-GT活性;E.仔猪血清LDH活性差异

A.仔猪血清LDL-C含量;B.仔猪血清HDL-C含量;C.仔猪血清TG含量;D.仔猪血清TC含量

2.4 玉米和玉米淀粉对仔猪肠道黏膜相关基因表达的影响通过qRT-PCR检测CDX2、PCNA、OCLN、CLDN1、MUC2和TNFα mRNA水平。结果显示,与玉米组相比,CDX2和TNFα mRNA表达量显著下调(P<0.05),PCNA、OCLN和CLDN1表达量极显著下调(P<0.01),MUC2 mRNA表达量不变(图6)。结果提示玉米淀粉饲料可能抑制肠黏膜细胞的分化、增殖、物理屏障和免疫屏障等,对化学屏障无影响。

图6 玉米和玉米淀粉对仔猪十二指肠屏障相关基因表达的影响

2.5 玉米和玉米淀粉对仔猪肠道黏膜Wnt信号通路的影响通过qRT-PCR和Western blot检测2种饲料对十二指肠黏膜关键调节信号通路Wnt/β-catenin的活性。如图7所示,淀粉组Wnt10b、β-catenin及Cyclin D1 mRNA表达量均极显著下调(P<0.01)。检测蛋白水平结果显示,淀粉组Wnt10b和C-myc蛋白表达量极显著下调(P<0.01),β-catenin和Cyclin D1明显受到抑制(图7B、C)。结果提示玉米淀粉饲料抑制肠道Wnt信号通路的活性。

3 讨论

断奶期为仔猪生长发育过程中的关键阶段。在此期间,仔猪消化器官发育及功能还未健全,免疫力低下,容易受到饲料及其他各种因素影响而造成消化和吸收紊乱,进而导致仔猪营养不良、生长受阻甚至死亡[1]。此时饲料的组成、形态和营养水平等因素尤为重要。本研究通过利用常用的能量原料玉米和玉米淀粉配制饲料饲喂断奶仔猪,并平衡2组的能量和营养水平,探究两者影响肠屏障发育的差异。研究结果显示玉米淀粉组仔猪的生长性能降低,机体代谢受到抑制,十二指肠的pH值增加,且绒毛的生长受到抑制。分子水平研究显示,玉米淀粉组仔猪十二指肠黏膜分化、增殖基因和屏障相关基因表达受到抑制,且Wnt/β-catenin信号通路活性降低,表明相对玉米饲料,玉米淀粉饲料可抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性抑制肠道黏膜屏障发育,进而可能影响仔猪的健康和生长性能。比较2种饲料的营养水平发现,其中淀粉组的中性洗涤纤维含量明显较低,其可能是导致肠道屏障发育差异的因素之一。

A．qRT-PCR检测仔猪十二指肠黏膜Wnt/β-catenin号通路相关基因mRNA表达量;B．Western blot检测仔猪十二指肠黏膜Wnt/β-catenin信号通路蛋白条带;C．蛋白灰度扫描结果

中性涤纤维(NDF)是植物细胞壁中大部分结构性成分(即纤维素、半纤维素、木质素等不可溶纤维和不溶灰分),能够较准确的反映纤维的实际含量。早前已有报道指饲料中纤维对生猪养殖的重要性。多项研究表明提高饲料中纤维素比例,可提高日粮的营养价值和高蛋白质消化率。利用添加小麦麸等不同纤维原料可改变食糜的水结合能力以及在消化道停留时间均会增加,影响营养物质的吸收[11]。添加5%的玉米纤维能显著降低断奶仔猪料肉比分、总能量、有机物、干物质消化率,显著增加粗纤维和磷消化率等,显著影响仔猪生长[12]。此外,膳食纤维会使胃部分蛋白质水解增加,回肠蛋白质表观消化率提高6%,粪便蛋白质表观消化率显著提高5%[13];回肠淀粉酶的活性提高43%[14]。但断奶仔猪肠道容积小,发育不成熟且由于断奶应激导致肠道损伤,对纤维素的消化能力弱,常常需要限制粗纤维的含量。而适当的纤维有助于缓解仔猪断奶时的不适并促进其生长。在31日龄的断奶仔猪饲中额外添加1%的粗纤维浓缩物可以显著增加仔猪平均日增质量、平均日采食量和饲料利用率,以及早期的生长激素水平,从而提高仔猪的生长[15]。同时添加可溶性纤维和不溶性纤维的日粮更有效改善血液生化指标、营养物质消化率、后肠微生物和肠道屏障功能;如同时加入0.5%可溶性纤维和0.5%不可溶性纤维能显著上调了回肠屏障功能相关基因(OCLN、CLDN-1、MUC1和IL-10);增加了回肠食糜中的乳酸菌数量等[16]。本研究发现低中性洗涤纤维的淀粉饲料组断奶仔猪的增重受到抑制,采食量减少,通过血液生化指标检测发现机体肝脏代谢和脂肪代谢均受到抑制。推测,中性洗涤纤维可能是影响断奶仔猪营养物质消化率重要因素,同时也可能是影响肠道黏膜的重要因素,影响仔猪机体代谢。

肠道黏膜上皮细胞主要完成营养素的感应、转运和吸收,是维持肠道自身和机体营养代谢的基础,其中杯状细胞可分泌黏液形成黏液层[17]、潘氏细胞分泌免疫因子[18]与紧密连接一起构筑肠道屏障,共同维持肠道的稳态和机体正常的生长发育过程[19]。饲料中添加纤维素会刺激肠道发育,比如增加肠道绒毛细胞增殖、绒毛的生长和隐窝的加深[14]。分别给断奶仔猪饲喂NDF水平为6.7%,7.7%,8.7%和9.7%的饲粮,其中9.7% NDF饲粮可以显著增加仔猪小肠各段的绒毛高度和隐窝深度及改善仔猪腹泻[9]。本研究通过肠道HE染色观察肠绒毛形态发现低中性洗涤纤维淀粉饲料会导致肠道的绒毛变稀,细胞数量变少;基因表达水平显示,肠道黏膜屏障相关基因CDX2、PCNA、OCLN、CLDN1和TNFα表达量显著降低,与前期报道在饲料中添加不可容纤维[16]或较高纤维含量[9]可更有效刺激仔猪肠道绒毛发育相符,提示降低中性洗涤纤维可能会影响肠道黏膜的发育。日粮中适宜的纤维素水平,对促进断奶仔猪肠道微生态平衡也有积极作用[16,20]。此外,饲料中的纤维素导致的未消化蛋白减少,能减少肠胃微生物由于未消化蛋白和断奶应激造成的微生物失衡,有利于预防仔猪断奶后腹泻影响仔猪的生长性能[21]。本研究中玉米淀粉可显著增加十二指肠的pH值,可能会造成十二指肠微生物失衡以及蛋白质的消化效果不佳。可推测低中性洗涤纤维不利于刺激肠道黏膜的发育,影响肠道并降低屏障功能不利于相关营养物质的充分消化吸收和抵御外界致病因子,导致仔猪腹泻。其对肠道微生物屏障的调节仍需进一步分析。

Wnt信号通路是哺乳动物肠道分化和免疫的重要信号通路[22]。其在肠道上皮隐窝底部非常活跃,可以促进干细胞自我更新和分化,在维持肠道干细胞和前体细胞稳态的过程中发挥着重要作用,同时在促进潘氏细胞的成熟和分泌免疫因子方面非常关键[23],这有利于维持肠道各种屏障的完整。在小鼠活体水平和类器官水平研究表明SIRT2缺陷可促进Wnt/β-catenin信号传导使潘氏细胞谱系增加,肠道上皮增殖增加[24]。在体外培养肠道类器官时,Wnt3a分泌因子可与Lgr4/5配体R-spondin协同作用,诱导潘氏细胞的成熟[25]。其中肠道上皮潘氏细胞顶部有防御素、溶菌酶、磷脂酶A2和sIgA等多种抗菌分子,成为肠道黏膜屏障的免疫效应分子,是宿主防御细菌、真菌、病毒或者原虫等入侵的重要分子屏障,并影响相关部位的微生物群体的组成[26]。本研究结果显示,淀粉饲料会导致Wnt/β-catenin信号通路的活性显著受到抑制,可能会抑制肠道黏膜细胞的分化和增殖,抑制潘氏细胞的成熟和免疫因子的分泌,影响肠道黏膜物理屏障和免疫屏障的分子机制,最终影响肠道的发育和功能。