不同产地野菊花的质量分析

匡秀华,姜亚洁,2,张彩燕,3,谷亚慧,张 琪,樊克锋,李利红

(1.河南牧业经济学院 动物医药学院,河南 郑州 450046; 2.河北工程大学 生命科学与食品工程学院,河北 邯郸 056038; 3.江苏沙钢集团有限公司,江苏 张家港 215625)

野菊花是菊科植物野菊的头状花序。野菊花味苦、辛、微寒,归肝、心经,具有清热解毒、泻火平肝的功效[1]。现代药理和中药归经理论的研究表明,野菊花中主要含有黄酮类(如槲皮素、木犀草素、蒙花苷等)、挥发油、多糖等成分,具有抗菌、抗炎、镇痛和抗氧化活性等作用[2-5]。《中华人民共和国兽药典》(2020版)[1]和《中华人民共和国药典》(2020版)[6]均收录了野菊花,表明了其较高的药用价值。

随着我国施行“兽用抗菌药使用减量化行动”,农业农村部颁布的第194号 “退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种”公告。2013年农业农村部第2038号公告将野菊花作为天然植物饲料原料收录于《天然植物饲料原料目录》,2018年我国颁布了《天然植物饲料原料通用要求国家标准(GB/T 19424—2018)》[7]文件,中兽药在临床养殖中的应用受到重视。野菊花作为天然植物饲料原料,其开发和利用也备受关注。但野菊花产地广泛,质量参差不齐,进行野菊的质量分析和鉴别工作是当前的迫切需求。本试验从野菊花的外观与性状、显微鉴别与薄层鉴别、水分、总灰分与酸不溶性灰分、蒙花苷含量测定等方面进行分析,为天然植物饲料原料的质控方法提供技术参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

分析天平(BSA224S- CW,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);生物显微镜(BX43,奥林巴斯(中国)有限公司);薄层色谱成像系统(GoodLook-1000,上海科哲生化科技有限公司);高效液相色谱仪(Ultimate-300,赛默飞世尔科技有限公司);野菊花对照药材(AP80511,中国食品药品检定研究院);蒙花苷对照品(B20860-20 mg,中国食品药品检定研究院。)

按照北京中兽药联盟制定的《天然植物饲料原料团体标准制定样品规范》,征集13批次不同产地天然植物饲料原料野菊花,经中兽药教研室鉴定为正品。野菊花样品详细信息见表1。

表1 13批野菊花样品来源信息

1.2 试验方法

1.2.1 外观与性状

依照《天然植物饲料原料通用要求国家标准(GB/T 19424—2018)》[7]的要求,从形状、大小、表面、断面、气味等方面进行观察,同时要求药材和饮片外观不得有虫蛀、发霉、其他物质污染等异常现象。

1.2.2 显微鉴别与薄层鉴别

参照2020版《中华人民共和国兽药典》[1]进行显微鉴别。参照2020版《中华人民共和国药典》[6]进行薄层鉴别。

1.2.3 水分

参照GB/T 6435《饲料中水分的测定》[8],采用直接干燥法测定样品水分。

1.2.4 总灰分与酸不溶性灰分

参照2020版《中华人民共和国兽药典》[1]进行操作和检测。

1.2.5 蒙花苷含量测定

参照2020版《中华人民共和国兽药典》[1],采用高效液相色谱法(HPLC)测定蒙花苷含量。

2 结果与分析

2.1 不同产地野菊花的外观与性状

不同产地的13批野菊花样品粉碎前(图1)与粉碎后(图2)的外观性状差异较大。图1为13批样品粉碎前,形状为类球型舌状花,各样品无明显差异。质地干燥易碎。花苞为黄色至棕黄色,皱缩卷曲;有4～5个苞片,外苞片呈长条形,外表面有白毛。内苞片椭圆形、无毛,芽底有残梗。直径约0.3～1 cm,3、6、11、13号样品直径较大,约0.5～1 cm,其余样品直径约0.3～0.5 cm。断面有明显纹理及光泽度。气味芳香、略带苦味。眼观3、6、10、11、13号样品有较多杂质。所有样品粉碎前无虫蛀、无发霉、无污染。图2为13批样品粉碎后,黄棕色和黄白色,虽不同产地有明显的外观、色泽差异,但外观、色泽与2020版《中国药典》和2020版《中国兽药典》要求基本一致。

图1 不同产地13批野菊花样品粉碎前外观与性状

图2 不同产地13批野菊花样品粉碎后外观与性状

2.2 不同产地野菊花的显微鉴别

粉碎后的13批野菊花样品显微特征如下:花粉粒呈黄色、类球形,直径20～33 μm(图3A)。腺毛头部鞋底形,4～8个细胞,两面相对排列(图3B)。T型毛很多,但大部分已断。臂一长一短,是单细胞。壁稍厚或一侧稍厚,密集分布在茎、茎叶表面(图3C)。分泌道含黄色分泌物,直径9～34 μm,周围有一组导管,多见于花柱中部(花柱分叉以下)、药隔中心和苞片(图3D)。

2.3 不同产地野菊花薄层鉴别

蒙花苷对照品在紫外光灯(365 nm)下检视出现一个点(图4),1～13号野菊花样品中,3、6、10、13号样品在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上显示的荧光斑点颜色较淡,11号样品无荧光斑点;其中4号样品在展开时,斑点扩散,样品3号受影响。

RM:蒙花苷对照品、RCD:野菊花对照药材、1～13:13批不同产地的野菊花样品图4 不同产地野菊花样品薄层图谱

2.4 不同产地野菊花的水分测定

经检测可得(表2),13批不同产地野菊花样品水分范围在8.2%～10.7%,平均值为9.7%,其中6号样品水分最大,12号样品水分最小;以GB/T 6435《饲料中水分的测定》为标准,13批样品中6号和10号样品水分超过10%。

表2 不同产地野菊花的水分检测 %

2.5 不同产地野菊花的总灰分与酸不溶性灰分检测

经检测(表3),13批不同产地野菊花样品的总灰分范围6.78%～8.90%,平均值为7.95%,其中1号最小,13号最大;酸不溶性灰分范围0.27%～1.98%,平均值为0.96%,其中7号最小,11号最大。

表3 野菊花总灰分与酸不溶性灰分检测结果 %

2.6 不同产地野菊花蒙花苷含量检测

由图5可知,蒙花苷对照品的保留时间约为13.3 min,13批样品中有11批样品在保留时间上出现蒙花苷的特征性峰(图6)。

图5 蒙花苷对照品HPLC图谱

图6 13批野菊花样品HPLC叠图

由表4可以看出13批样品蒙花苷含量范围为0.000%～2.1492%,平均值为0.9424%。13批样品中有7批样品蒙花苷含量超过0.80%,3、6、8、10、11、13号样品的蒙花苷含量未超过0.80%,其中3号、11号样品未检测到蒙花苷。

表4 不同产地野菊花样品中蒙花苷含量检测 %

3 讨论

本试验对不同产地的13批野菊花样品进行质量分析,结果显示,所有样品的外观与性状与《中华人民共和国兽药典》(2020版)标准基本一致。13批不同产地野菊花大小、颜色存在差异,可能受地域、海拔等多方面因素影响。自然条件下,植物生长发育、器官形成及次生代谢产物积累与生态因子密切相关[9]。野生菊花在海拔18 m～1083 m内皆有分布,但植株形态差异较大[10],产区集中分布在大别山、伏牛山和秦岭南部山脉的低海拔山区,不同产地及海拔的自然环境的野菊花化学成分含量差异较大[11]。

蒙花苷的薄层鉴别过程中,因《中华人民共和国兽药典》中使用的展开剂部分成分毒性较大,借鉴和采用《中华人民共和国药典》中用乙酸丁酯-甲酸-水(2∶1∶1)的上层溶液为展开剂。研究表明,点样量为1～5 μL时显色效果较好,斑点清晰可见[12]。而本试验中,点样量需增加至21 μL时荧光斑点清晰、易于观察。因此,蒙花苷的薄层鉴别中点样量需因样品不同而调整。

毛佩芝[13]运用烘干法测定144批野菊花水分含量范围为7.41%～15.9%。本试验中13批野菊花样品的水分范围在8.2%～10.7%,平均值为9.7%,与其检测结果相一致。此外,有研究报道52批野菊花的总灰分含量范围为6.38%～8.00%,平均含量为7.23%,酸不溶性灰分含量为0.72%～1.76%,平均含量为1.22%[14]。本试验中13批不同产地野菊花样品的总灰分含量范围6.78%～8.90%,平均值为7.95%;酸不溶性灰分含量范围0.27%～1.98%,平均值为0.96%,与文献报道略有差异,可能是由于样品批次较少,样品产地不同及样品品种差异等。

李浩文等[15]采用流动相为0.05%磷酸溶液-乙腈,波长为334 nm,测得不同批次野菊花中蒙花苷含量范围为0.417%～1.507%。武秀丽等[16]采用流动相为乙腈-0. 02% 磷酸溶液,检测波长为326 nm,检测到39批次野生野菊花中蒙花苷的含量为0～15.40 mg/g。许雷等[17]以甲醇-水-冰醋酸(26:23:1)为流动相,检测波长为334 nm,检测到50个野菊花样品中蒙花苷含量在0～3.83%,合格率为56%。本试验中采用的流动相和检测波长同2020版《中国兽药典》,测得13批野菊花样品中蒙花苷平均含量为0～2.15%,与文献报道类似。此外,在检测蒙花苷的过程中,在水相中加入少量的磷酸,可以改善峰形,减少拖尾等问题;若同时升高柱温、降低体积流量可以使相邻色谱峰分离更好[18]。

2020版《中国兽药典》和《中国药典》中,以蒙花苷为定量定性的标志物。对39批次野生野菊花按照2020版《中国药典》进行检测,其中有9份样品未检测到蒙花苷[16]。本试验中也有2批样品未检测到蒙花苷,但用HPLC指纹图谱法对29批野菊花样品进行检测,检测出绿原酸、咖啡酸和蒙花苷等7个化合物[19]。这提示,仅以蒙花苷含量来判定野菊花质量不够全面。运用灰色关联度分析和Pearson相关分析,发现蒙花苷含量受年均气温、年均降水量、纬度与海拔等影响[20]。因此,建立合理、有效的质量标准是评价野菊花作为天然植物饲料原料的重要前提之一。