鞣花酸对马兜铃酸I所致肾小管上皮细胞毒性的保护作用

舒广文，雷霄，付千，阿尔斯拉·玉苏甫，孙慧，邓旭坤

（中南民族大学 药学院 & 民族药学国家级实验教学示范中心，武汉 430074）

马兜铃酸I（aristolochic acids I，AAI）是马兜铃属植物［1-2］主要细胞毒性成分之一，具有强烈的肾毒性. 肾脏中有五类固有细胞类群——系膜细胞、内皮细胞、足细胞、间质成纤维细胞和肾小管上皮细胞. AAI可直接毒害肾小管上皮细胞，从而干扰肾脏的正常功能. 有研究表明，AAI可通过上调人HK-2肾小管上皮细胞中NLRP3炎症小体主要组分的表达水平来激活该通路. NLRP3炎症小体通路的激活在AAI毒害HK-2细胞过程中起到了关键性作用［3］.

鞣花酸（ellagic acid，EA）是一种广泛存在于多种水果中的天然多酚类化合物［4］. 近年来，鞣花酸被应用于临床疾病的预防与治疗中，同时鞣花酸的药理作用及作用机制也值得进一步的研究. 一方面，EA可通过抗氧化、抗凋亡、抗炎等途径来缓解顺铂诱导的小鼠急性肾损伤［7］. 另一方面，EA对NLRP3炎症小体通路也具有潜在的干预作用［8］. 然而，目前尚不明确EA是否可以缓解AAI所致的肾小管上皮细胞损伤. 因此，本文研究了EA对AAI所致的人HK-2细胞毒性的保护作用和可能机理.

1 材料与方法

1.1 HK-2细胞株

HK-2细胞株购自武汉大学典藏中心，由实验室自传代储存，按照文献所述的方法培养［7］.

1.2 试剂与仪器

AAI（纯度 ≥ 99%，江苏永健科技）；EA（纯度 ≥98%，宝鸡辰光）；MEM培养基/胎牛血清（武汉普诺赛）； Hoechst 33258染色液（生工生物）；Annexin V/FITC-PI染色试剂盒（碧云天）；噻唑蓝（MTT）（美国Sigma）；Trizol裂解液、逆转录/扩增试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（南京建成生物研究所）；磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、NLR家族Pyrin域蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosisassociated speck-like protien，ASC）、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、白介素1β（IL-1β）抗体、磷酸化核因子-kappa B p65（p-NF-κB p65）抗体、核因子-kappa B p65（NF-κB p65）抗体、核因子-kappa B （NF-κB）抑制剂（Bay 11-7082）（武汉爱博泰克）；预染发光Western Marker、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）.

BDS200-PH倒置显微镜（奥特光学）；ABI-2720 PCR扩增仪（美国Thermo）；Western Blot显影仪（上海天能）；流式细胞仪（美国BD）；全波长酶标仪（ASCENT）； ABI-2720 PCR扩增仪（美国Thermo）.

1.3 MTT与LDH细胞毒性评价

参考文献方法［8-9］，进行细胞活力的MTT检测以及细胞培养液中的LDH活性分析.

1.4 Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡

参考文献方法［10］进行Hoechst 33258染色，然后在荧光显微镜下观察并拍照.

1.5 Annexin V/PI流式细胞双染法检测细胞凋亡

用AnnexinV-FITC、PI染色液对细胞进行染色［11］，避光室温孵育15 min，流式细胞仪检测.

1.6 Western bolt检测细胞内蛋白的表达

参考文献方法［2，12］，提取细胞内的蛋白. 一抗室温孵育2 h后用相应的酶标二抗室温下孵育1 h，然后显色，Image J软件对所得条带进行定量和分析.

1.7 定量反转录PCR（qRT-PCR）检测炎症小体相关基因表达水平变化

采用TRIzol试剂盒提取总RNA，然后用文献方法进行qRT-PCR［13］. 扩增引物的序列如表1所示. 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.

表1 反转录PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences used for PCR

1.8 统计学分析

实验结果均以均数 ± 标准差 （Mean ± SE）表示，所有的数据差异通过单因素方差分析（ANOVA）进行统计学分析，P＜ 0.05被认为差异具有统计学意义. 采用Image J软件对荧光结果图进行量化处理和Western blot条带的灰度分析.

2 结果

2.1 EA缓解AAI所致的HK-2细胞毒性

在AAI的作用下，HK-2细胞活力（MTT值）下降，细胞培养液中LDH活性上升，提示AAI对HK-2细胞具有毒害作用. EA明显缓解AAI诱导的HK-2细胞毒性（图1（a）和（b））. 另一方面，在AAI的作用下，HK-2细胞核内可见碎块状致密浓染. 经EA处理后，核内致密蓝色荧光信号逐渐减少（图2）. 流式细胞分析结果则显示，AAI处理可导致明显的细胞凋亡. EA则剂量依赖性地抑制了AAI所致的HK-2细胞凋亡，提高了存活细胞在细胞群体中的占比（图3）.

图1 EA对AAI诱导的HK-2细胞存活率的影响（a）和细胞培养液中LDH水平的影响（b）Fig.1 Effect of EA on survival rate of AAI-induced HK-2 cells （a） and LDH level in cell culture medium （b）

图2 HK-2细胞的Hoechst 33258染色结果（a）和有致密浓染的细胞核占总细胞核的百分比统计（b）Fig.2 EA alleviated AAI-provoked apoptosis in HK-2 cells（a）as indicated by Hoechst 33258 staining assay（b）

图3 HK-2的流式细胞术分析结果（Annexin V/PI双染）Fig.3 Flow cytometry analysis of HK-2 cells （Annexin V/PI double staining）

2.2 AAI诱导HK-2细胞内NLRP3炎症小体组分编码基因的转录

如图4（a）所示，随着AAI处理浓度的增加，NLRP3炎性小体主要组分NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β编码基因的转录水平逐渐上升. 类似地，随着AAI处理时间延长，HK-2细胞内NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β编码基因的mRNA含量明显增加（图4（b））. 以上研究结果提示AAI能上调NLRP3炎性小体主要组分基因表达.

图4 AAI对HK-2细胞内NLRP3炎症小体各组分编码基因转录的影响Fig.4 Effects of AAI on transcriptions of the encoding genes of NLRP3 inflammasome components in HK-2 cells

2.3 AAI激活HK-2细胞内NF-κB通路

在AAI的作用下，HK-2细胞内NF-κB p65的磷酸化水平呈时间和剂量依赖性地增高（图5（a）和（b）），AAI能激活HK-2细胞中的NF-κB信号通路. NF-κB抑制剂Bay（10 μM）能阻断AAI对HK-2细胞内NF-κB通路的激活作用. 与此同时，NLRP3、Caspase-1和IL-1β水平均被Bay明显下调（图5（c））. 这表明，在HK-2细胞中，激活NF-κB是AAI诱导NLRP3炎性小体主要组分基因表达的关键性上游分子事件.

图5 AAI激活HK-2细胞内NF-κB/NLRP3通路Fig.5 AAI activates the NF-κB/NLRP3 cascade in HK-2 cells

2.4 EA阻断AAI对NF-κB/NLRP3通路的激活作用

EA既明显阻断了AAI对NF-κB的激活作用（图6（a）），又明显干预了AAI诱导的NLRP3炎性小体主要组分编码基因的转录和翻译（图6（b）和（c））.EA对AAI所致HK-2细胞毒性的保护作用可能与干预AAI对NF-κB/NLRP3级联的激活有关.

图6 EA对HK-2细胞中NF-κB/NLRP3信号通路的影响Fig.6 Effect of EA on NF-κB/NLRP3 signaling in HK-2 cells

3 讨论

目前关于EA对AAI肾小管上皮细胞毒性缓解作用的认识尚不十分明确. 因此，本文探讨了EA对AAI所致HK-2肾小管上皮细胞损伤的保护作用. 在AAI的作用下，HK-2细胞MTT比色值下降，细胞培养液中的LDH活性上升，提示AAI对HK-2细胞有明显的细胞毒性［14-15］. EA对AAI所致的细胞MTT值下降和培养液LDH值上升都有明显的缓解作用，提示EA可有效缓解AAI所致的HK-2细胞活力下降.

以往研究表明，NF-κB在病理状态相关的肾损伤过程中起到关键性作用：NF-κB通路的激活可通过诱发肾内炎症反应而导致肾损伤［16］. 在糖尿病肾病大鼠模型中，肾脏内NF-κB活性明显增加［17］， 六味地黄丸可抑制其活化并明显缓解肾损伤. 另一方面，NF-κB亦与各种外源性物质所致的肾损伤紧密关联. 在急性酒精性肾损伤大鼠模型中，肾内NF-κB异常激活. 给予NF-κB抑制剂后，肾损伤则得到显著的减轻［18］. 与之类似，天然化合物桂皮醛抑制肾内NF-κB并缓解皮质酮诱导的小鼠肾损［19］. 苏木酮A亦通过抑制NF-κB来缓解顺铂所致的肾损伤［20］.与以上研究结果一致的是，本研究表明AAI能明显上调HK-2细胞中NF-κB p65亚基的磷酸化. EA则能明显阻断这一分子事件，提示抑制NF-κB可能在EA缓解AAI所致的肾小管上皮细胞毒性过程中起到关键性作用.

NF-κB可启动NLRP3炎症小体主要组分编码基因的转录. 本研究结果表明，用NF-κB抑制剂BAY可阻断AAI对NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β编码基因的转录上调作用. 这提示在HK-2细胞中，NF-κB在AAI激活NLRP3炎症小体通路过程中起到了重要作用. NLRP3炎性小体是机体固有免疫的重要组分，其异常激活在肾损伤过程中扮演了关键性角色. 在脓毒血症所致大鼠急性肾损伤过程中，可检测到肾内NLRP3通路的大幅度激活［21］. 缺血-再灌注这一病理状态也通过激活NLRP3通路引起肾损伤. 给予吡非尼酮后，肾内NLRP3通路被抑制，缺血-再灌注所致的大鼠急性肾损伤得到明显改善［22］. 相类似，天然化合物大黄素可通过阻断NLRP3来缓解草酸钙结晶诱导的肾小管上皮细胞损伤［23］. 在实验性IgA肾病大鼠模型中，NLRP3炎性小体被异常激活. 当给予阿托伐他汀抑制NLRP3炎性小体通路后，肾损伤被明显改善［24］. 与以上研究结果一致的是，EA能明显干预AAI诱导的NLRP3炎性小体通路活化. 这表明EA对HK-2肾小管上皮细胞的保护作用可能与阻断NF-κB/NLRP3级联紧密相关.

综上所述， EA具有缓解AAI所致HK-2肾小管上皮细胞毒性的功能，为临床上防控AAI肾毒性提供了一个潜在的新思路. 进一步研究表明，AAI能激活HK-2细胞内的NF-κB通路并且上调NLRP3炎性小体主要组分基因表达. EA则阻断了AAI对HK-2细胞内NF-κB的激活作用， NLRP3相关基因的表达也随之下降. 以上研究结果提示：AAI与EA两个化合物分别通过激活或阻断NF-κB来间接影响NLRP3，从而产生细胞毒性或保护活性. AAI与EA两个化合物中未见可在细胞培养条件下发生化学反应的官能团，难以发生化合物间的相互影响. 因此，干预NF-κB/NLRP3通路可能在EA发挥肾细胞保护作用过程中发挥关键性作用.