粉花西伯利亚杏花色变化的生理特性研究

董胜君，范雯萱，张云程，王蓬锴，陈建华，李 彪

（1.沈阳农业大学林学院，沈阳 110161；2.辽宁省喀左县林业种苗管理站，辽宁 喀左 122300）

植物花色不仅是观赏植物的重要品质特征，同时也是鉴定与区分不同花品种的重要指标之一[1]。花朵在开放过程中的色彩变化是由多种因子共同作用、相互影响的结果[2]，较多研究虽对花色变化与内在机制进行了报道，但不同植物或同种植物的不同花色品种内在机制变化差异较大，多种差异导致了花色多样性，而最重要的影响因子为花瓣中的色素种类和含量[3-5]。植物体内主要包含的色素种类有类黄酮、类胡萝卜素和甜菜碱。类胡萝卜素可使花瓣呈黄色、橙色等颜色[6]，甜菜碱可使花瓣呈红色或黄色[7]。类黄酮是一种重要的参与植物发育的次生代谢产物，其中花青素作为类黄酮产生的化合物之一，可为植物提供红色、蓝色、紫色等多种颜色[8]，花青素的甲基化、糖基化和酰基化都会使花色发生变化[7]。外界环境同样会对花青素的合成产生影响，如温度可通过影响与花青素合成相关的酶活性间接影响其合成，光照会通过光质、光照度和光照时间影响花青素的生物合成等[9]，进一步影响花瓣呈色。目前对于花瓣色素种类和含量的研究已在木槿[10]、紫花含笑[11]、睡莲[12]等植物中展开，对于粉花西伯利亚杏花色形成及调控机理探究尚未见报道。

西伯利亚杏（Prunus sibirica）为蔷薇科杏属乔木或灌木，多分布于我国东北及华北各省。其树形优美，喜光，根系发达，具有抗寒、抗旱、耐贫瘠、适应性强等特点，不仅是保持水土、防风固沙的优良生态树种，还具有较高的经济价值[13]。西伯利亚杏初春开花，花色多为白色或粉白色，鲜有粉色。本研究所选育出的特异种质因其盛开时花瓣粉红、花瓣数5～10 枚不等、花萼色泽对比普通西伯利亚杏更深而更具观赏价值[14-15]，可作为我国东北及华北地区的观赏性植物。目前关于西伯利亚杏花的研究多集中于表型及变异分析[16]、开花基因调控[17-18]以及嫁接繁殖技术上[15]。本研究以沈阳农业大学山杏国家林木种质资源保存库的粉花西伯利亚杏为研究对象，以白花西伯利亚杏为对照材料，对开花过程中的花色参数、细胞液pH 值、色素指标及生理指标进行测定和分析，以探究粉花西伯利亚杏呈色机理，为花色变异的品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以粉花西伯利亚杏花瓣为供试材料，以白花西伯利亚杏花瓣为对照，各材料均选自沈阳农业大学山杏国家林木种质资源保存库（东经119°24′54″～120°23′24″，北纬40°47′12″～41°33′53″），样木树龄6～7 a。选择3 株长势一致、生长健壮且无病虫害的样木，于花后1 d（花芽顶端绽开露粉或露白）、11 d（花瓣呈气球状且即将展开）、15 d（花瓣全部展开）和19 d（花瓣萎蔫即将凋落）进行4次取样（图1），于8∶30-10∶30在每株样木的东、西、南、北4 个方向分别选择标准枝，每个标准枝选择50～60 朵花。同一株样木的花瓣采集完装入锡纸包好，标注日期及样本编号后马上投入到液氮罐中，带回实验室后转入-80 ℃冰箱中保存待测。

图1 西伯利亚杏开花过程中的形态及花色Figure 1 Morphology and flower color during anthesis of Prunus sibirica

1.2 测定项目及方法

1.2.1 花色参数测定方法 选取新鲜花瓣将其平铺于白纸上，放置在室内自然光源下，利用CR-10PLUS型色差仪进行测色。对花瓣明度L*值、红度a*值和黄度b*值进行测定，再利用公式C*=（a*2+b*2）1/2，h=arctan(b*/a*)获得彩度C*值和色相角h。每个样品均进行3次生物学重复，最终数值取平均数。

1.2.2 细胞液pH值测定方法 参考唐前瑞等[19]的方法测定花瓣细胞液pH值，并略有改动。取0.5 g新鲜花瓣放入研钵中，加入2 mL蒸馏水研磨至匀浆，用PHS-3E型pH计测定匀浆pH值，用匀浆pH值代替花瓣细胞液pH值。每个样品均进行3次生物学重复，最终数值取平均数。

1.2.3 色素含量测定方法 类黄酮含量的提取与测定采用Flavonoid Kit比色试剂盒法（南京建成生物工程研究所）；花青素含量的提取与测定参照余秋岫[11]的方法；类胡萝卜素及叶绿素的提取与测定采用乙醇浸提法[21]。

1.2.4 生理指标测定方法 可溶性糖含量的提取与测定采用蒽酮比色法；可溶性蛋白含量的提取与测定采用考马斯亮蓝G-250染色法；脯氨酸含量的提取与测定采用茚三酮法；超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用氮蓝四唑还原法；过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚比色法；过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用紫外分光光度法[22]。

1.3 数据处理方法

采用SPSS 22.0进行数据处理与分析，结合独立样本t检验法进行显著性差异分析，各指标间进行相关性分析和逐步回归分析，采用Origin 2021绘制图表。

2 结果与分析

2.1 粉花西伯利亚杏花瓣花色参数变化

CIELAB标准色度系统可以较为客观和科学地描述花瓣颜色。由表1可知，在开花过程中粉花西伯利亚杏花瓣的L*值呈先升高后降低趋势，a*值和C*值呈先降低后升高趋势，b*值和h值呈持续上升趋势。L*值代表花色明暗程度，粉花花瓣在花后15 d 达到了明度最大值，白花西伯利亚杏花瓣则在花后11 d 达到最大值。a*值代表花色红绿程度，数值越大，花色越趋于红色。粉花花瓣a*值为正，白花花瓣a*值为负，二者均在花后1 d达到最大值。b*值代表花色黄蓝程度，数值越大，花色越趋于黄色。粉花与白花花瓣开花过程中的b*值最大值均出现在花后19 d。h值变化趋势有所差异，粉花花瓣h值变化呈“持续上升”趋势，白花花瓣则呈“先升高后降低”趋势。粉花花瓣的L*值在花后11 d和15 d均极显著低于白花花瓣，在花后1 d和19 d均显著低于白花花瓣；a*值始终极显著高于白花花瓣；b*值在花后11 d和15 d均极显著低于白花花瓣，在花后1 d和19 d均显著低于白花花瓣；C*值在花后1 d极显著高于白花花瓣，在花后11 d显著高于白花花瓣。在花后15 d极显著低于白花花瓣，在花后19 d显著低于白花花瓣；h值始终极显著高于白花花瓣。

表1 西伯利亚杏不同时期花瓣花色参数Table 1 Petal color parameters of Prunus sibirica at different periods

2.2 粉花西伯利亚杏花瓣细胞液pH值变化

细胞液pH 值大小是花瓣呈色稳定与否的重要因素。由图2可知，粉花西伯利亚杏在开花过程中花瓣细胞液pH 值处于酸性范围内，呈逐渐上升趋势，在花后19 d 达到最大值。粉花花瓣细胞液pH 值为5.14～5.45，白花西伯利亚杏花瓣细胞液pH 值为5.28～6.16。二者比较，在花后11 d 和19 d 粉花花瓣的细胞液pH 值均极显著低于白花花瓣，花后1 d 和15 d 显著低于白花花瓣。

图2 不同时期花瓣细胞液pH值Figure 2 pH values of petal cell fluid at different periods

2.3 粉花西伯利亚杏花瓣色素含量变化

花瓣呈色的根本原因是植物细胞中存在特定色素，其种类和含量共同影响花瓣的最终颜色。由图3可知，粉花西伯利亚杏花瓣内类黄酮含量变化呈逐渐下降趋势，花后19 d 粉花花瓣和白花西伯利亚杏花瓣类黄酮含量比花后1 d 分别下降64.23%和80.23%。4个时期粉花花瓣内类黄酮含量均极显著高于白花花瓣，分别是白花花瓣的2.04，1.50，2.05，3.70倍。

图3 不同时期花瓣内类黄酮含量Figure 3 Flavonoid contents in petals at different periods

由图4可知，粉花花瓣内花青素含量均呈先升高后降低趋势，粉花花瓣和白花花瓣的花青素含量均在花后11 d达到峰值，与花后1 d相比上升幅度分别为25.84%和370.44%。粉花花瓣内花青素含量在4个时期均极显著高于白花花瓣，分别是白花花瓣的36.92，9.88，8.80，4.34倍。

图4 不同时期花瓣内花青素含量Figure 4 Anthocyanin contents in petals at different periods

由图5可知，粉花花瓣内类胡萝卜素含量均呈逐渐下降趋势，花后19 d粉花花瓣和白花花瓣类胡萝卜素含量比花后1 d分别下降77.33%和70.51%。粉花花瓣内类胡萝卜素含量在花后1 d和15 d均极显著高于白花花瓣，分别是白花花瓣的1.44 和1.86 倍，花后11 d 显著高于白花花瓣，是其含量的1.34 倍，花后19 d 二者含量无显著差异。

图5 不同时期花瓣内类胡萝卜素含量Figure 5 Carotenoid contents in petals at different periods

由图6可知，粉花花瓣内叶绿素含量均呈先升高后降低趋势，粉花花瓣和白花花瓣叶绿素含量分别在花后11 d和15 d达到峰值，与花后1 d相比上升幅度分别为311.36%和193.33%。粉花花瓣叶绿素含量在花后1 d和11 d 均极显著高于白花花瓣，分别是白花花瓣的1.47 和2.35 倍，在花后15 d 和19 d 同样高于白花花瓣，但此时二者含量无显著差异。

图6 不同时期花瓣内叶绿素含量Figure 6 Chlorophyll contents in petals at different periods

2.4 粉花西伯利亚杏花瓣内渗透调节物质含量变化

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸为植物体内的渗透调节物质，参与植物体内的各种生命代谢活动，直接或间接地影响着花色苷的合成，对植物花瓣的花色形成起促进作用。由图7可知，在开花过程中粉花西伯利亚杏花瓣内可溶性糖含量呈先升高后降低趋势，粉花花瓣和白花西伯利亚杏花瓣可溶性糖含量分别在花后11 d和15 d 达到峰值，与花后1 d 相比上升幅度分别为7.07%和4.50%。粉花花瓣内可溶性糖含量在花后11 d 和15 d均极显著高于白花花瓣，在花后1 d显著高于白花花瓣，分别是白花花瓣的1.06，1.10，1.06倍；仅在花后19 d低于白花花瓣，此时二者含量无显著差异。

图7 不同时期花瓣内可溶性糖含量Figure 7 Soluble sugar contents in petals at different periods

由图8可知，二者可溶性蛋白含量变化趋势有所不同。粉花花瓣内可溶性蛋白含量呈先降低后升高趋势，于花后11 d降至最小值，为4.85 mg·g-1，之后含量迅速增加，在花后19 d比花后11 d高92.16%。白花花瓣则呈先升高后降低趋势，前两个时期可溶性蛋白增长缓慢，在花后15 d 迅速增长至29.04 mg·g-1，比花后1 d 高135.71%。粉花花瓣内可溶性蛋白含量始终极显著低于白花花瓣，分别是白花花瓣的48.86%、37.54%、23.42%和36.79%。

图8 不同时期花瓣内可溶性蛋白含量Figure 8 Soluble protein contents in petals at different periods

由图9 可知，粉花花瓣内脯氨酸含量呈先升高后降低趋势，在花后15 d 达到峰值，粉花花瓣和白花花瓣脯氨酸含量分别比花后1 d 高231.88%和217.67%。粉花花瓣内脯氨酸含量在4 个时期均极显著低于白花花瓣，分别是白花花瓣的82.35%、68.47%、86.04%和66.07%。

图9 不同时期花瓣内脯氨酸含量Figure 9 Proline contents in petals at different periods

2.5 粉花西伯利亚杏花瓣内保护酶活性变化

保护酶可清除花瓣中的活性氧自由基，对花色呈色及变化具有重要作用。由图10 可知，在开花过程中粉花西伯利亚杏花瓣内SOD酶活性呈先升高后降低趋势，在花后15 d达到峰值。粉花和白花西伯利亚杏花后15 d花瓣内的SOD 酶活性与花后1 d相比增长幅度分别为66.77%和76.98%。粉花花瓣内SOD 酶活性在花后11 d和19 d 均极显著高于白花花瓣，分别是白花花瓣的1.29 和1.39 倍，在花后1 d 和15 d 均显著高于白花花瓣，分别是白花花瓣的1.16和1.10倍。

图10 不同时期花瓣内SOD酶活性Figure 10 SOD activity in petals at different periods

由图11 可知，粉花花瓣内POD 酶活性呈持续升高趋势，在花后19 d 达到最大值。粉花和白花花后19 d 花瓣内的POD 酶活性与花后1 d 相比增长幅度分别为343.76%和550.00%。前3 个时期粉花花瓣内POD 酶活性均极显著高于白花花瓣，分别是白花花瓣的1.44，1.83，1.50 倍，但花后19 d 低于白花花瓣，此时二者POD 酶活性无显著差异。

图11 不同时期花瓣内POD酶活性Figure 11 POD activity in petals at different periods

由图12 可知，粉花花瓣内CAT 酶活性变化呈持续升高趋势，在花后19 d 达到最大值。花后19 d 粉花和白花花瓣内CAT 酶活性与花后1 d 相比增长幅度分别为62.69%和40.61%。各时期粉花花瓣内CAT 酶活性均极显著高于白花花瓣。花后1 d 二者CAT 酶活性均最低，粉花花瓣为白花花瓣的2.38 倍，至花后19 d 升至最高，粉花花瓣为白花花瓣的2.76倍。

图12 不同时期花瓣内CAT酶活性Figure 12 CAT activity in petals at different periods

2.6 粉花西伯利亚杏花瓣花色参数与各指标的相关分析

由表2可知，粉花西伯利亚杏花瓣L*值与a*值呈显著负相关，与b*值无显著相关。L*值与C*值、类黄酮含量呈极显著负相关，与类胡萝卜素含量呈显著负相关；与SOD 酶活性、脯氨酸含量呈极显著正相关，与POD 酶活性、叶绿素含量呈显著正相关。a*值与CAT 酶活性、SOD 酶活性、POD 酶活性、脯氨酸含量呈极显著负相关，与b*值、色相角h、细胞液pH 值、可溶性蛋白含量呈显著负相关；与C*值、类黄酮含量、类胡萝卜素含量呈极显著正相关，与花青素含量呈显著正相关。由此可见类黄酮含量、类胡萝卜素和花青素含量的增加会提高粉花花瓣的红度值，使其颜色更粉，与此同时明度值随之降低，花色深沉；反之细胞液pH 值、CAT 酶活性、SOD 酶活性、POD酶活性、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量的增长会使花色红度值降低，而花色明度值提高。b*值与花青素含量、类胡萝卜素含量、可溶性糖含量呈极显著负相关，与类黄酮含量呈显著负相关；与5项指标呈极显著正相关，分别为色相角h值、细胞液pH值、可溶性蛋白含量、CAT酶活性和POD酶活性。

表2 粉花西伯利亚杏花瓣各指标间的相关系数Table 2 Correlation coefficients among the indicators of Prunus sibirica pink flower petals

2.7 粉花西伯利亚杏花瓣花色参数与各指标的逐步回归分析

在上述相关分析中，较多因素与花色均具有显著相关性，因此将进一步从各指标中找到对花瓣a*值和b*值影响最显著的因子。在5%的显著水平下，淘汰不显著自变量，选出偏回归系数达到显著或极显著水平的因子，进入花色的回归方程。由表3 可知，在粉花花瓣a*值的逐步回归方程中，保留了花青素和SOD酶活性2 个因子，其余全部被剔除；在b*值的逐步回归方程中，仅保留了色相角h这1 个因子。这一结果表明，花青素对粉花西伯利亚杏花瓣的呈色具有重要作用。

表3 粉花西伯利亚杏花瓣各指标与花色的逐步回归分析Table 3 Stepwise regression analysis of each index of Prunus sibirica pink flower petals and flower color

3 讨论与结论

植物花色研究对观花树种的评价和选育均具有重要意义，是创新花色的关键性过程[11]。植物花色的表达和评价一般采用CIELAB标准色度系统，它能对花色进行专业性描述及分类[23]。本研究通过对粉花西伯利亚杏开花不同时期的花瓣花色参数进行测定，发现各时期二者花瓣的花色参数均存在显著或极显著差异。粉花花瓣的L*值和a*值呈显著负相关，在长春花[8]和野牡丹[24]的研究中同样发现了类似的规律，但与b*值无相关性。在标准色度系统中a*值代表红度值，b*值代表黄度值，在对羊蹄甲[25]花色的研究中发现，宫粉紫荆花瓣的L*值与a*值呈极显著负相关，表明其花色主要受红度值影响，而羊蹄甲花瓣的L*值与b*值呈极显著正相关，表明其花色主要受黄度值影响。因此，在粉花西伯利亚杏花色的研究中，花色参数a*值较b*值更具参考意义。

细胞液pH值大小与花色稳定与否密切相关[26]，pH值越低，花色越呈现更稳定的红色，伴随着花瓣生长，pH值会出现升高现象[27]。相关分析中表明，粉花花瓣pH 值与a*值呈显著负相关关系，在开花过程中粉花花瓣内pH 值逐渐增大，外观上也表现为花瓣粉色逐渐变淡。在对二乔玉兰的研究中发现，开花过程中花瓣外表从红紫色变为淡紫色，蕾期至盛花期细胞液pH值表现为持续增长，但各时期差异均不显著[28]。本研究中粉花西伯利亚杏各时期pH值差值较小，而花色同样发生了变化，表明pH值的微小变化也会影响粉花西伯利亚杏花瓣呈色。

存在于植物细胞中的色素是影响花色的主要因素，色素种类、含量及组成比例均会影响花瓣颜色[7]。本研究通过相关分析和逐步回归分析，发现与花瓣红度a*值相关的关键色素为花青素，推测其是影响粉花西伯利亚杏花瓣颜色的主要因素，花青素也是影响紫花含笑[11]、丽格海棠[30]等植物花瓣呈色的色素。值得注意的是，在花后11 d 粉花花瓣内花青素达到峰值，此时红度a*值却未达到最大值，在关于深色花的相关研究中发现使花色变深的原因不仅是单方面花青素持续积累，也有显微结构下的色素分布[31]、花瓣结构特点以及其他色素的共同作用等多方面因素[32]。相关分析中，粉花花瓣的类黄酮含量和类胡萝卜素含量与红度a*值呈极显著正相关，二者含量的变化，一定程度上对花瓣呈色起辅助作用。大量叶绿素积累会使花瓣呈绿色[7-8]，本研究中虽在粉花花瓣中检测出叶绿素，但对比其他3类色素含量较低，且相关分析中与红度a*值无相关性。在花后15 d和19 d对比白花西伯利亚杏含量也无显著差异，推测叶绿素对粉花西伯利亚杏花瓣呈色的影响较小。

可溶性糖作为能源物质维系着植物的正常生长发育，可与花青素以糖苷键结合形成花色苷[24]，花色苷的含量会影响花瓣呈色，尤其是粉红、红色、紫色、红紫色等深色花[33]。本研究中粉花花瓣内的可溶性糖与花青素含量变化趋势一致，且均在花后11 d 达到最大值，二者同步积累并合成[34]。可溶性糖作为合成花色苷的原料，其含量间接对花瓣呈色产生影响。前人研究发现花色苷的生成随着蛋白质增加而减弱[35]。本研究中，粉花花瓣内可溶性蛋白含量与花青素含量呈极显著负相关，在红花玉兰[36]花色形成的研究中同样发现了类似的规律。脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质，具有稳定细胞膜结构及保护酶、清除活性氧等功能[37]，可为花色苷合成提供稳定的内部环境[38]，间接影响花色的变化。

SOD酶、POD酶和CAT酶同为花瓣内清除自由基的保护酶[29]。本研究中，CAT酶活性随着粉花的开花进程持续上升，且与花青素含量具有极显著负相关关系，表明其活性会通过参与花瓣内一系列生理代谢过程，直接或间接地影响花色苷的降解速度，从而影响粉花西伯利亚杏花瓣呈色[24-25]。SOD 酶活性和POD 酶活性与花青素含量无相关性，表明其活性变化对粉花西伯利亚杏花瓣呈色的影响较小。

综上所述，粉花西伯利亚杏与白花西伯利亚杏所处环境相似，排除立地条件对花色的影响，二者花色差异是花瓣色素含量、细胞液pH、渗透调节物质及保护酶活性共同作用、相互影响的结果。其中，花青素作为影响粉花西伯利亚杏花瓣呈色的主要因子，其含量变化会直接影响粉花花瓣不同时期的颜色呈现。该研究探讨了粉花西伯利亚杏花瓣颜色形成的因素和机制，可为西伯利亚杏花色调控及花色变异的品种培育创新提供理论参考。