犬瘟热病毒实时荧光定量PCR 检测方法的建立

郝良玉，郭衍冰，刘沂霖，尚丽元，冯 凯，浩佳艺，李昱洁，王改丽

吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春 130062

犬瘟热是犬瘟热病毒(CDV)引起的一种急性、高度接触性、严重发热性传染病。CDV 为副黏病毒科麻疹病毒属成员，有多种细胞趋向性，导致全身感染。病毒粒子呈高度多形性，直径约150 nm，通常为椭圆形或球形、不分节段的单股负链RNA(ssRNA)。CDV 基因组包含15 690 个核苷酸，由6个独立且非重叠转录单位(N-P-M-F-H-L)构成基因组结构，N 基因是核衣壳的主要组成部分，具有较强保守性，不仅与病毒的转录调控和复制相关，而且在病毒逃避宿主先天免疫应答中发挥重要作用。

1 材料

1.1 细胞、毒株及样品

MDCK 细胞、犬瘟热病毒疫苗株CDV3由中国农科院特产研究所特种动物病原与免疫实验室保存，犬细小病毒（CPV）灭活疫苗株由本实验室保存，犬冠状病毒（CCV）由本实验室分离鉴定并保存。

1.2 主要试剂

Premix Taq 酶、反转录试剂均购自Takara 公司；病毒核酸提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购于天根公司；SYBR GreenI 染料购自Roche 公司。

2 方法

2.1 设计引物

参考CDV3N 基因序列（GenBank 登录号：EU7 26268.1）的保守区域设计特异性引物，P1：5'-T GAGCCACGCCACGACA-3'，P2：5'-TCCCAGGTTGACTGAG CATCT-3'，目的基因扩增片段长度为116 bp。

2.2 扩增N 基因

取低温保存的CDV3病毒液，参照病毒RNA 提取试剂盒说明书提取病毒RNA，随即将其反转录成cDNA。PCR 扩增试验以cDNA 为模板，待反应完成后向2%的琼脂糖凝胶加入扩增产物5 µL，用于电泳检测。PCR 扩增条件及反应体系如表1 所示。

表1 PCR 扩增条件及反应体系

2.3 制备标准品

回收、纯化扩增产物连接pMD18-T 载体，并转化至感受态细胞，接种在含氨苄抗性的固体培养基倒置培养过夜，取单菌落接种于含氨苄抗性的液体培养基培养，PCR 鉴定质粒后送往生工测序。利用Qubit3 荧光定量仪测定质粒浓度，并按拷贝数＝[6.02×1023×浓度(ng/µL)×10-9]/(质粒长度×660)计算拷贝数。

2.4 优化反应条件及标准曲线的建立

阳性标准品经梯度稀释后作为模板，采用单变量法依次优化引物浓度、退火温度、复性时间等，按照SYBR GreenI 说明书配制实时荧光定量PCR 扩增体系，总体系为20 µL，多次重复以确定最佳反应条件并绘制标准曲线。

2.5 灵敏度试验

以倍比稀释的标准质粒为模板进行扩增，阴性对照选用无菌去离子水代替模板，以Ct 值＜35 且出现标准“S”型扩增曲线的浓度作为本方法的最低检测限度。

2.6 重复性试验

不同稀释度分别设置3 个样品进行荧光定量PCR 重复性试验，通过变异系数(CV)=标准偏差（SD）/平均数，计算组内和组间各Ct 值的变异系数。

2.7 特异性试验

用病毒RNA 提取试剂盒提取CCV 基因组RNA，随即反转录合成cDNA；用病毒DNA 试剂盒提取CPV基因组DNA。应用优化SYBR GreenI 荧光定量PCR方法进行扩增，设置阴性对照，验证并比较其特异性。

3 结果与分析

3.1 CDV3 N 基因PCR 扩增结果

提取CDV3基因组，反转录成cDNA 后，利用针对N 基因所设计的特异性引物进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物检测，得到与目的片段116 bp 大小一致的扩增片段。

3.2 实时荧光定量PCR 反应体系及条件的优化

优化后扩增总体系20 µL，其中SYBR 酶10 µL，上、下游引物各1 µL，质粒模板1 µL，无菌去离子水7 µL，最终反应程序：预变性95 ℃ 5 min；荧光检测95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，运行40 个循环。该反应体系可获得良好扩增曲线，PCR 产物呈单条带。

3.3 标准质粒浓度测定及拷贝数计算

使用Qubit3 荧光定量仪测定标准质粒浓度为35.2 ng/µL，经公式计算得到标准质粒的拷贝数为2.77×1012拷贝/µL。

3.4 标准曲线的建立

分 别 以2.77×101～2.77×107拷 贝/µL 的标准质粒进行实时荧光定量PCR，循环数（y）与标准质粒拷贝数的对数（lgC）关系式为y=2.4857X+15.524，扩增相关系数R2=0.9865。结果表明，本方法建立的标准曲线线性关系良好，各稀释度间相关性强，误差较小，可准确反应目的基因的扩增。实时荧光定量PCR 熔解曲线结果为单峰型曲线，扩增产物在77 ℃出现单一波峰，无引物二聚体和非特异扩增峰。

3.5 灵敏度试验

倍比稀释标准质粒浓度后进行试验，结果显示当标准质粒拷贝数为2.77 拷贝/µL 时，才有扩增曲线出现，而2.77×10-1拷贝/µL 无扩增曲线，故本方法最低检出限度为2.77 个拷贝。

3.6 重复性试验

以不同稀释度标准质粒为模板分别进行组内和组间重复试验。结果见表2，组内Ct 值变异系数为0.77% ～1.31%，组间Ct 值变异系数为0.89%～1.21%，表明本方法复现性强。

表2 CDV3 实时荧光定量PCR 重复性结果

3.7 特异性试验

本方法检测犬细小病毒DNA 及犬冠状病毒cDNA均无荧光信号，表明方法特异性良好，对犬细小病毒及犬冠状病毒均无特异性扩增，不会产生交叉反应。

4 讨论与结论

犬瘟热呈世界性分布，发病率及死亡率很高，临床以双相热、胃肠炎、急性呼吸系统炎症和神经症状为主。其病毒宿主范围不断扩大，对各地的野生动物和濒危物种保护构成威胁。CDV、CPV 和CCV都可引起严重腹泻，特点是传染性极强、感染后发病速度快、死亡率高。受感染犬从患病初期无症状到亚临床、急性发病期的感染症状十分相似，难以鉴别诊断。因此，建立快速准确鉴定这些病毒的新型诊断方法一直是研究的热点与难点。

检测犬瘟热病毒主要有免疫学检测技术[1]、分子生物学检测技术[2]及基因芯片检测技术等方法。在PCR 反应体系中加入指示DNA 片段扩增过程的荧光染料或荧光标记的特异性探针，实时监测荧光信号的积累，通过检测病毒核酸达到检测目的，即为实时荧光定量PCR 方法。与探针法相比，染料法简便且成本更低，单PCR 产物可与多分子染料相结合，因此SYBR GreenI 染料法灵敏度高，信噪比高，样品荧光信号强。检测结束后通过熔解曲线分析产物，进行扩增产物和引物二聚体的识别，以区分是否存在非特异扩增，保证检测结果更加准确。

本试验针对CDV3N 基因的保守序列片段设计了特异引物，经单变量法优化条件建立SYBR GreenI荧光定量PCR 方法，该方法特异性强，与CPV、CCV 常见犬肠道病毒无交叉反应。本方法最低检测限为2.77 拷贝/µL，优于传统PCR 方法；组内及组间重复性试验Ct 值的变异系数均低于1.21%，表明本方法重复性良好，在临床诊断中具有可行性，能够应用于犬瘟热病毒检测及分子流行病学调查。