棉花种子萌发期耐盐机理初探

王宁，霍飞超，张逸彬，石建斌，许庆华，严根土，刘晓红

（1.中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物育种及产业技术国家工程研究中心，河南 安阳455000；2.新疆前海种业有限责任公司，新疆 图木舒克 843900）

据不完全统计，全球约有9.55 亿hm2的土地在遭受盐渍化的侵蚀，盐碱胁迫是限制农作物生产的重要因素之一[1]。我国是世界上盐碱地面积最大的国家之一，盐渍化土壤总面积约为1 亿hm2，约占全国可耕地面积的25%，并且由于不合理的灌溉，农业区的土壤次生盐渍化问题日益严峻，严重威胁着我国农业的可持续发展[2]。因此，合理地开发和利用盐碱地资源，已成为我国农业发展的重要方向。

棉花是我国重要的经济作物，具有较强的耐盐碱能力，被认为是改良盐碱地的先锋植物之一[3]。据不完全统计，我国约有2.7×106hm2的盐碱地先后被开发用于植棉，已成为世界上盐碱地植棉规模最大的国家[4]。虽然棉花是一种较耐盐的农作物，但土壤中盐分含量过高也会对棉花的生长发育产生严重的危害，尤其是在萌发期和苗期[3]。棉花在盐碱地种植时，易出现种子萌发受到严重抑制、出苗困难甚至死苗等现象，严重制约了盐碱地区的棉花生产[3，5-6]。

种子萌发过程中其新陈代谢极为旺盛，种子吸水膨胀会激活糖酵解、三羧酸循环和戊糖磷酸等多条代谢途径，促进高分子内含物降解进而为萌发生长提供能量。已有研究表明，盐胁迫能显著抑制萌发期种子中的油脂降解、糖酵解和三羧酸循环等能量代谢过程，进而降低种子活力、抑制种子萌发出苗[7-9]。γ- 氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid, GABA）是广泛存在于植物中的一种非蛋白质氨基酸，其内源合成主要依赖于谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase,GAD）催化谷氨酸发生脱羧反应[10]。植物中的GABA 代谢途径是从三羧酸循环延伸出来的一个分支，又称GABA 支路，与能量代谢密切相关，对盐胁迫下种子发芽及幼苗形态建成至关重要[7]。为研究棉花种子萌发期的耐盐机理，本研究以5 个不同基因型的棉花种子为供试材料，研究盐胁迫对种子萌发相关指标、GAD 活性、GABA含量和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）含量等的影响，初步探索棉花种子萌发期耐盐的内在机理，为培育耐盐棉花品种提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用不同类型及生态区域的5 个棉花品种（系）为研究材料，其中优质丰产的中棉9001[11]、丰产多抗的中棉所49[12]以及盐敏感型棉花品系中J0102[13]均来自中国农业科学院棉花研究所，优质高产宜机采的塔河2 号[14]和新陆中82 号[15]由新疆塔里木河种业股份有限公司提供。

1.2 试验设计

种子发芽试验采用纸上发芽法。以200 mmol·L－1的NaCl 溶液进行盐胁迫处理（S），以加相同体积的蒸馏水处理为对照（CK）。选取大小均匀且饱满的棉花种子用10%（体积分数）的H2O2浸泡消毒15 min，再用蒸馏水反复冲洗数次，均匀放置于铺有2 层滤纸的直径为20 cm 的培养皿中，每皿加15 mL 的NaCl 溶液或蒸馏水后播入50 粒种子，每个处理设置3 次重复。将培养皿放置于光照/黑暗时间为14 h/10 h、昼夜温度为28 ℃/20 ℃、相对湿度为80%的人工气候培养箱中培养。

1.3 种子萌发指标的测定

在棉花种子萌发期，每隔24 h 调查1 次萌发种子数和根长，在萌发第4 天结束实验。参照兰艳等[16]的方法统计分析相对发芽率、相对根长、平均发芽时间、种子活力指数等萌发指标。

1.4 GAD 活性、GABA 含量和ATP 含量的测定

种子萌发48 h 后，分别测定种子中的GAD 活性以及GABA 和ATP 的含量。

将冰浴中研磨后的新鲜样品（0.1 g）与1 mL 提取缓冲液[含0.05 mmol·L－1的Tris-HCl、1 mmol·L－1的乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）、1%（体积分数）的蛋白酶抑制剂和10%（体积分数）的甘油]混合，将所得匀浆在4 ℃、8 000g转速下离心10 min，然后使用GAD 活性试剂盒（Solarbio，北京）测定640 nm 处的吸光度值，按照试剂盒说明书计算GAD 活性。

取0.1 g 新鲜样品与7%（体积分数）的乙酸混合，置于95 ℃水浴中提取2 h，然后在25 ℃、8 000g转速下离心10 min。收集上清液，用GABA 试剂盒（Omin，上海）测定GABA 含量。

取冰浴中研磨好的0.1 g 新鲜样品，加入含0.6%三乙胺- 磷酸和0.1 mmol·L－1EDTA 的饱和酚溶液[7]，然后用ATP 含量试剂盒（Solarbio，北京）测定不同样品中的ATP 含量。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 16.0 软件对试验数据进行正态性检验，确认其符合正态分布后进行双因素方差分析，并用邓肯多重范围检验进行多重比较。利用DPS V7.05 统计软件进行数据处理，采用主成分分析和通径分析等方法进行相关分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对棉花种子萌发及种子活力指标的影响

盐胁迫明显抑制了不同棉花材料的种子萌发。萌发第4 天，供试棉花材料的相对发芽率为43.5%～86.3%，相对根长为40.0%～76.5%（图1），表明上述棉花材料在萌发期的耐盐性存在差异。其中，中J0102 受盐胁迫的抑制程度最重，萌发第4 天的相对发芽率和相对根长分别为43.5%和40.0%；新陆中82 号受盐胁迫的抑制程度最轻，萌发第4 天的相对发芽率和相对根长分别为86.3%和75.5%；盐胁迫下，塔河2 号、中棉9001 和中棉所49 的相对发芽率分别为65.3%、78.0%和68.8%，而相对根长分别为65.6%、69.2%和65.2%。

图1 盐胁迫下不同棉花材料种子的相对发芽率（A）和相对根长（B）

CK 处理下，中棉9001 种子的平均发芽时间显著长于新陆中82 号、中棉所49 和中J0102 （图2A）。盐胁迫显著延长了不同棉花材料种子的平均发芽时间，其中中J0102 的平均发芽时间最长，新陆中82 号的平均发芽时间最短。

图2 2 种处理下不同棉花材料种子平均发芽时间（A）和种子活力指数（B）的比较

CK 处理下，塔河2 号和中棉9001 的种子活力指数较高（图2B）；盐胁迫显著降低了不同棉花材料的种子活力指数，其中中J0102 的种子活力指数最低，仅为正常条件下的11.0%；新陆中82 号受盐胁迫的抑制程度最小，其种子活力指数为CK 的56.5%；盐胁迫下，塔河2 号、中棉9001 和中棉所49 的种子活力指数分别为CK 的31.6%、36.6%和37.9%。

2.2 盐胁迫对萌发期棉花种子中GABA 含量、GAD 活性和ATP 含量的影响

由图3A 所示，与CK 相比，盐胁迫显著增加了不同棉花材料萌发期种子中的GABA 含量。其中：盐胁迫下新陆中82 号的GABA 含量最高，较CK增加2.74 倍；与CK 相比，盐胁迫下塔河2 号、中棉9001、中棉所49 和中J0102 的GABA 含量分别增加2.29 倍、2.84 倍、2.29 倍和2.08 倍。

种子萌发期，与CK 相比，盐胁迫显著提高了棉花种子中GAD 的活性（图3B）。在盐胁迫下，塔河2 号、中棉9001、新陆中82 号、中棉所49 和中J0102 的GAD 活性分别是CK 的2.12 倍、2.13 倍、2.19 倍、1.87 倍和1.62 倍。

种子萌发期，与CK 相比，盐胁迫显著降低了不同棉花材料种子中的ATP 含量（图3C）。其中：中J0102 种子受盐胁迫的抑制程度最重，ATP 含量较CK 降低了65.4%；新陆中82 号受盐胁迫的抑制程度最轻，ATP 含量较CK 降低了16.4%；与CK相比，盐胁迫下塔河2 号、中棉9001 和中棉所49的ATP 含量分别降低了28.3%、24.2%和26.5%。

2.3 萌发期棉花种子各测定指标的主成分分析和通径分析

根据各项测定指标的相似性，主成分分析将不同处理下不同基因型的棉花材料分为4 类（图4）。CK 条件下，不同的棉花材料点聚在一起，表明此条件下不同棉花材料萌发期各指标之间的相似性较高。盐胁迫下，主成分分析将不同基因型的棉花材料分为3 类：中棉9001 和新陆中82 号点聚到一起，塔河2 号和中棉所49 点聚到一起，中J0102 单独归为一类。

图4 不同处理下棉花材料各测定指标的主成分分析结果

为探究影响种子萌发期棉花生长的主要因素，以根长（y）为因变量，以种子发芽率（x1）、平均发芽时间（x2）、种子活力指数（x3）、GAD 活性（x4）、GABA 含量（x5）和ATP 含量（x6）为自变量进行多元线性逐步回归，剔除无显著性的变量，以筛选出影响萌发期根生长的重要性状。在本研究条件下，种子活力指数（x3）和ATP 含量（x6）对根长（y）有显著影响，其回归方程为y＝1.25＋0.91x3＋1.05x6（决定系数R2＝0.942）。种子活力指数和ATP 含量均对根长有显著的正向直接效应，其直接通径系数分别为0.536 和0.455。同时，种子活力指数和ATP 含量还可以通过彼此对根长产生较强的正向间接效应。种子活力指数和ATP 含量与根长的简单相关系数分别为0.950 和0.963（表1）。

表1 萌发期种子活力指数和ATP 含量与根长的通径分析结果

3 讨论与结论

种子萌发期是种子植物实现种群更新和延续的关键时期，萌发过程中的物质代谢对种子成功发芽及植株形态建成至关重要[3，8，17-18]。在高盐胁迫下，植物不能有效调节体内的离子平衡，从而导致能量代谢发生紊乱，造成种子萌发率、发芽势和发芽指数降低，生长受到抑制[7-8，17-18]。本研究发现，盐胁迫显著降低了萌发期种子中的ATP 含量，从而降低了不同棉花材料的种子活力、种子发芽率以及根的生长，与先前的研究结果[3，7，9]一致。通过种子萌发相关指标的比较和主成分分析表明，不同基因型棉花材料的耐盐性表现为中棉9001、新陆中82 号＞塔河2 号、中棉所49＞中J0102。根据笔者等先前的研究结果，中棉所49 属于中等耐盐型品种，而中J0102 属于盐敏感型材料[3，7]。据此推测，新陆中82号和中棉9001 属于强耐盐型品种，塔河2 号属于中等耐盐型品种。

在植物体内，GABA 支路作为三羧酸循环的回补反应，可为植株抵抗逆境胁迫提供能量[7，9]。本研究结果表明，盐胁迫显著增加了萌发期种子中GABA 合成关键酶GAD 的活性，从而提高了GABA含量；不同基因型相比，盐胁迫下耐盐型品种（新陆中82 号和中棉9001）萌发期种子中的GAD 活性和GABA 含量较高，而盐敏感型材料中J0102 种子中的GAD 活性和GABA 含量最低。结合盐胁迫下耐盐性较强的棉花品种具有较高ATP 含量的结果推测，盐胁迫下耐盐性较强的棉花品种可能通过上调GABA 支路参与三羧酸循环，为种子萌发过程提供较多的能量。同时，通径分析表明ATP 含量对根长具有较强的显著正效应。综上，盐胁迫条件下，萌发期棉花种子可通过调节GABA 支路代谢途径促进ATP 的生成，进而更好地适应外界盐胁迫环境。