钆塞酸二钠增强MRI结合T1mapping术前预测肝细胞癌CK19表达及列线图构建＊

关星群 刘子蔚 郭保亮 刘 伟 陈新杰 胡秋根

广东省南方医科大学顺德医院 (佛山市顺德区第一人民医院)放射科(广东 佛山 528300)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，是我国发病率第4位及死亡率第3位的恶性肿瘤，其分子特征及组织学存在高度异质性[1-2]。既往研究表明，HCC根据其分子特征可分为增殖型和非增殖型两类[3-5]，而细胞角蛋白19(cytokeratin-19，CK19)是增殖型HCC的重要标志物。CK19是公认的胆管/祖细胞标志物和肿瘤干细胞标志物，在促进HCC的恶性程度方面起着重要作用。与CK19阴性HCC相比，CK19阳性患者的淋巴结转移和肝内复发的发生率更高，预后较差[6-7]。目前对CK19表达的评估主要依靠术前穿刺活检或术后的免疫组化，但均属于有创检查，因此如何通过无创手段对CK19表达进行精准预测，对患者后续治疗及预后至关重要。

钆塞酸二钠(gadoxetate disodium，Gd-EOB-DTPA)增强MRI结合T1mapping技术不仅能够反映组织的形态学改变，更能反映其功能状态变化。既往研究表明，肿瘤边缘不规则，DWI靶征，更低的肿瘤-肝脏的信号比可以作为预测CK19表达的独立影响因素[8-9]。另外有文献报道，Gd-EOB-DTPA增强MRI T1mapping定量成像技术能够有效的肝脏局灶性病变及乙型肝炎肝纤维化[10-11]，并对HCC病理学分级有较高价值[12]。然而，基于Gd-EOB-DTPA增强MRI结合T1mapping定量预测HCC CK19表达风险的研究国内尚未见报道。故本研究目的是探讨Gd-EOB-DTPA增强MRI结合T1mapping列线图模型在术前预测HCC CK19表达中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究选取2019年7月至2022年6月期间我院穿刺或手术病理证实的HCC患者98例，其中男 89 例、女9例，年龄37～82(56.60±10.69)岁。根据CK19免疫组织化学结果将患者分为 CK19 阳性组(35例)和 CK19阴性组(65例)。

纳入标准：患者进行了Gd-EOB-DTPA增强MRI扫描及T1mapping扫描(包含平扫及肝胆期T1mapping图像)；MRI扫描前未经放、化疗等任何形式的抗肿瘤治疗；在MRI扫描后2周内行穿刺或手术切除，术后病理明确诊断为HCC并进行CK19 免疫组织化学检测。排除标准：术前进行过临床治疗者；术后复发者；各种原因导致的MRI及病理图像不能满足观察需要者。

1.2 检查设备与方法所有患者均采用3.0T超导MRI(西门子，Skyra 3.0T MR)，采用腹部专用线圈，膈肌导航技术扫描，主要扫描序列包括(1)横断位T2WI，主要参数：TR 1300 ms，TE 97 ms，层厚6mm，视野360mm×280mm，矩阵203×320；(2)T1mapping，采用T1Map-双翻转角VIBE序列，并进行B1mapping匀场校正，序列扫描完后自动生成mapping图像，其主要参数：TR 5.01 ms，TE 2.3 ms，层厚4 mm，双翻转角(3°、15°)，视野 380 mm×285 mm，矩阵224×168；(3)DWI，主要参数：TR 6200 ms，TE 50 ms，层厚5 mm，双b值(50、1000 s/mm2)，视野 380 mm×285 mm，矩阵128×128；(4)T1WI-VIBE序列，主要参数: TR 4.00 ms，TE 1.29、2.52 ms，层厚3 mm，视野 380 mm×380 mm，矩阵320×240。采用Gd-EOB-DTPA(普美显，Bayer)进行增强扫描，剂量0.1 mL/kg，流速1.0 mL/s，另30 ml生理盐水冲管。肘静脉注射对比剂后采用T1WI-VIBE序列进行增强MRI扫描，包括增强前期(preenhancement，Pre)、动脉期(30s)(arterial phase，AP)、门静脉期(60s)(the portal venous phase，PP)、平衡期(120s)(equilibrium phase，EP)和肝胆特异期(20 min)(hepatobiliary Phase，HBP)。

1.3 临床资料与常规放射学定性特征分析通过PACS系统收集患者的一般资料及实验室资料。包括：年龄、性别、肝炎(有/无)、白蛋白、总胆红素、结合胆红素、凝血酶原时间及国际标准化比值、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、乳酸脱氢酶、中性粒细胞/淋巴细胞比值(neutrophil to lymphocyte ratio，NLR)、血小板/淋巴细胞比值、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、血清肌酐。

由2名具有5年以上腹部影像诊断经验的医师在PACS系统上独立阅片，当意见存在分歧时通过协商达成一致。纳入的影像学定性征象有：(1)肿瘤累及范围；(2)病灶数量；(3)肿瘤大小；(4)肿瘤形状不规则；(5)非光滑肿瘤边缘；(6)出血；(7)坏死；(8)脂肪；(9)马赛克征；(10) DWI靶环样高信号；(11)动脉期边缘强化；(12)晕状强化；(13)瘤内动脉；(14)廓清；(15)包膜。(16)卫星结节。(17)瘤周低信号。

1.4 图像定量参数的测量及分析影像学定量参数由2名医生手工测量，取平均值。图像定量测量方法如下：(1)感兴趣区(region of interest，ROI)选择：选取病灶强化最明显的区域(避开出血、坏死、脂肪、血管和胆管区)，ROI的面积约为0.5～1.2 cm2，3次测量取平均值，注意保证每次测量ROI面积一致。同样方法测量同层面正常肝组织的信号强度(signal intensity，SI)。(2)分别测量AP、PP、EP、HBP四期肿瘤与正常肝组织SI，并计算肿瘤-肝实质信号强度比(Tumor to liver contrast ratio，TLR)、肿瘤增强指数(Tumor enhancement index，TEI)、肿瘤相对增强值(Relative tumor enhancement，RTE)和相对增强比(Relative enhancement ratio，RER)。(3)测量增强前T1mapping图像病灶的弛豫时间(T1rt-Pre)及肝胆期相同位置病灶的弛豫时间(T1rt-20min)。计算T1弛豫时间减低率(Reduction rate of T1 relaxation time，rrT1rt)，rrT1rt=(T1rt_Pre -T1rt_20min)/ T1rt_pre。(4)通过西门子后处理工作站测量病灶ADC值。

1.5 病理特征病理标本由2名具有5年以上诊断经验的病理科医师独立分析，当意见存在分歧时通过协商达成一致。通过免疫化学染色评估CK19的表达，采用鼠抗人细胞CK19单克隆抗体对肿瘤标本进行染色。每个病例在染色热点区选取5个高倍镜视野，取平均值，若≥5%，判定为CK19阳性，＜5%为CK19阴性。

1.6 统计学分析采用 SPSS 26.0软件及R软件(版本4.1.0)进行数据分析。首先通过KolmogorovSmirnov检验对各组数据行正态性分析，符合正态分布的计量资料采用t检验，采用均数±标准差描述；非正态计量资料采用Wilcoxon秩和检验，采用中位数(P25，P75)描述。两组间定性资料采用χ2检验或Fisher确切概率法。采用组内相关系数(intra-class correlation coefficient，ICC)用于评估观察者的组间及组内一致性。多因素Logistic回归用于确定CK19阳性HCC的独立影响因子。通过受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)预测CK19表达的诊断效能。校准曲线评估了列线图的拟合优度。结果以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料分析本研究共纳入HCC患者98例，其中CK19阳性35例，阴性63例。两组之间的临床特征详见(表1)。两组间的单变量分析结果显示甲胎蛋白、中性粒细胞与淋巴细胞的比值是与CK19状态相关的显著变量(P＜0.05)。其余临床特征在两组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 患者的临床特征

2.2 两组间MRI定性及定量特征的比较定性特征中，非光滑肿瘤边缘(P=0.005)、晕状强化(P=0.041)、卫星结节(P=0.040)的差异具有统计学意义(表2)。

表2 CK19阳性组及阴性组的常规放射学定性特征分析结果

MR影像定量参数一致性分析结果显示ICC值均在0.7以上，表明两名放射科医生对影像定量参数测量的一致性较好(表3)。定量参数中，T1rt-Pre、T1rt-20min的差异具有统计学意义(表3)。CK19阳性组与阴性组间的代表性病例见(图1～图2)。

表3 CK19阳性组及阴性组的EOB-MRI 定量参数分析结果

图1A～图1C CK19阳性HCC钆塞酸二钠增强MRI T1mapping图及病理图表现。患者女，67岁。平扫T1mapping病灶T1弛豫时间为1747±110msec(1A)。肝胆期T1mapping病灶T1弛豫时间为843±26msec(1B)。CK19阳性表达HCC病理图(1C)。图2A～图2C CK19阴性HCC钆塞酸二钠增强MRI图T1mapping及病理图表现。患者男，50岁。平扫T1mapping病灶T1弛豫时间为1303 ±28msec(2A)。肝胆期T1mapping病灶T1弛豫时间为748±19msec(2B)。CK19阴性表达HCC病理图(2C)。图3 预测CK19阳性HCC列线图。图4 列线图的ROC曲线。图5 列线图的校准曲线。

2.3 单因素预测CK19阳性HCC的诊断效能单因素分析结果显示T1rt-20min具有最好的诊断效能，曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.720 (0.620～0.806)，Youden指数为0.44，敏感度80.17%，特异性63.49%，临界值为＞797msec。详细的AUC值、敏感性及特异性见(表4)。

表4 肝细胞癌CK19表达的单因素指标诊断效能

2.4 构建预测模型及列线图多因素logistic回归分析结果显示AFP＞100ng/mL、T1rt-pre、T1rt-20min是CK19阳性HCC的独立预测因素(表5)。基于logistic回归确定的独立危险因素构建了预测CK19阳性HCC的列线图(图3)，列线图的AUC值为(0.870，95%CI：0.788，0.928)(图4)。校准曲线表明，预测CK19阳性HCC的概率与实际概率具有良好的一致性(图5)。

表5 预测肝细胞癌CK19表达多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

CK19是HCC预后的独立危险因素之一[13]。CK19通常在肝祖细胞或胆管细胞中表达，而不在肝细胞中表达[14]。表达CK19阳性的HCC被称为“双表型”HCC，约占HCC的20%[15]。与CK19阴性HCC相比，CK19阳性HCC具有侵袭性强、复发率高及预后差的特点[15-16]，本研究联合Gd-EOB-DTPA增强MRI和T1mapping技术开发了一个预测模型包括三个独立预测因子(AFP、T1rt-pre、T1rt-20min)并通过列线图展示，用于个体化预测HCC患者的CK19表达状态，显示了良好的鉴别能力。

本研究对临床特征与CK19状态进行分析，结果显示血清AF＞100ng/mL与CK19表达显著相关，与Chen[17]研究符合。AFP是一种临床生物标志物，它的表达与HCC的发生和发展密切相关，血清AFP水平与肿瘤细胞组织学分化程度、肿瘤转移、复发及微血管侵犯相关，这与CK19阳性HCC的高侵袭性生物学行一致[18]。

本研究对MR定量参数与CK19状态进行分析，结果显示基于T1弛豫时间的定量参数具有统计学差异，而基于SI的定量参数并无统计学差异。肿瘤细胞内Gd-EOB-DTPA的摄取与细胞膜上有机阴离子转运多肽(OATP1B1/B3)及多药耐药蛋白2(MRP2)的表达相关，在肿瘤细胞中OATP1B1/B3表达降低，而MRP2表达基本不变甚至增加[19-20]。笔者认为，CK19反应了HCC的增殖性，与CK19阴性的HCC相比，CK19阳性肿瘤细胞膜表面OATP1B1/B3表达更低或MRP2表达增加更明显，进而导致CK19阳性细胞对Gd-EOB-DTPA的摄取减少，T1弛豫时间延长，T1rt-20min值升高。本研究根据Logistic确定的预测HCC CK19阳性的独立危险因素构建了预测模型并通过列线图直观地展示。本研究表明，通过临床信息和MRI定量特征的结合可以在较好地预测CK19阳性HCC。

虽然 MRI征象上的非光滑肿瘤边缘、晕状强化和卫星结节以及临床特征中的NLR与HCC中的CK19状态组间存在差异，这与Hu[18]等人的发现相似。文献表明，CK19阳性HCC病理类型多表现为结节周围延伸型、多结节融合型或浸润型[21]，因此MRI上多表现为非光滑的肿瘤边缘[22]。瘤周晕状强化可能是肿瘤的侵袭引起门静脉微小分支闭塞，使门静脉血流量减少的区域继而出现代偿性动脉过度灌注，所以在动脉期晚期或门脉早期肿瘤周围肝组织出现三角形、楔形或斑片状异常强化[23]。卫星结节被证实为HCC肝切除术或肝移植术后预测复发的重要因素[24]，CK19表达与卫星结节形成显著相关[18]。与CK19阴性的HCC相比，CK19阳性的HCC更常出现不光滑的肿瘤边缘、晕状强化和卫星结节，说明CK19阳性HCC更具侵袭性，恶性程度更高。文献表明NLR升高与肿瘤预后不良相关，本研究显示 CK19阳性HCC的NLR多＞1.73，与Lee[25]的研究符合。遗憾的是，上述征象与CK19阳性HCC有关，并未能作为CK19的独立预测因子。故不能说明这些特征在临床实践中可以预测CK19阳性的HCC，因此在临床实践中应谨慎使用。

我们的研究存在一些局限性。首先，这是一项回顾性研究，因此难免会引入潜在的选择偏倚。其次，缺乏验证集，可能会影响我们结论的稳健性。因此，需要多中心、大样本量的数据来验证所提出的预测模型的性能。第三，部分病例仅行穿刺活检而非完整手术切除，部分混合型肝癌可能纳入研究，从而使CK19阳性病例增多，造成偏倚。

综上所述，基于钆塞酸二纳增强MRI和T1mapping可以预测HCC CK19阳性，联合了T1弛豫时间和AFP构建的列线图具有良好的预测效能，有望为HCC患者的后续治疗方案和预后评估提供重要的指导价值。