雪茄烟根腐病与土壤真菌群落和理化性状的相关性分析

樊俊　谭军　向必坤　施河丽　王瑞　谭绍安　肖亮　王雪松

摘要：為了解雪茄烟镰刀菌（Fusarium ）根腐病与土壤真菌群落及理化性状的关系，采用调查取样的方法，研究了湖北来凤县雪茄烟根腐病发病与未发病区域的根际土壤真菌群落多样性、土壤理化性状及其与病情指数的相关性。结果表明，相较于未发病根际土壤，根腐病发病减少了根际土壤真菌 Observed_species 、Shannon 、Simpson、Chao1、Ace 指数和拟本森顿酵母菌（Pseudobensingtonia）相对丰度，增加了镰刀菌（Fusarium ）相对丰度。根腐病病情指数与土壤含水量、毛管孔隙度、速效钾和 Fusarium 相对丰度呈显著正相关（p<0.05）；与土壤通气孔隙度和 Pseudobensingtonia 相对丰度呈极显著负相关（p<0.01）。典型相关分析表明，毛管孔隙度和通气孔隙度是影响雪茄烟根腐病发生的主要土壤因子。综合来看，降低土壤毛管孔隙度和Fusarium 相对丰度、提高土壤通气孔隙度和Pseudobensingtonia 相对丰度有利于防控雪茄烟镰刀菌根腐病的发生。关键词：雪茄烟；镰刀菌根腐病；真菌；理化性状；相关性分析

中图分类号： S435.72           文献标识码： A           文章编号：1007-5119（2023）01-0100-07

Correlation Analysis between Cigar Root Rot and Fungal Community， Physical and Chemical Properties of Soil

FAN Jun， TAN Jun， XIANG Bikun*， SHI Heli， WANG Rui， TAN Shaoan， XIAO Liang， WANG Xuesong

（Enshi Branch Company of Hubei Provincial Tobacco Corporation， Enshi 445000， Hubei， China）

Abstract： In order to understand the relationship between the occurrence of cigar Fusarium root rot and soil factors， we studied the soil fungi diversity and structural composition， physical and chemical properties and their relationship in Laifeng cigar producing areas with occurrence of cigar root rot. The results indicated that compared with uninfected control， the occurrence of cigar root rot caused  reduction  in  the  number  of fungal  species，  decreased  Shannon，  Simpson，  Chao1，  and  Ace  indexed  and  lower  relative abundance of Pseudobensingtonia and increased relative abundance of Fusarium in the rhizosphere soil. The disease index of root rot was significantly positively correlated with soil water content， capillary porosity， available potassium and the relative abundance of Fusarium （p<0.05）， and negatively correlated with soil aeration porosity and the relative abundance of Pseudobensingtonia （p<0.01）. Canonical correlation analysis showed that that soil capillary porosity and aeration porosity were the main soil factors affecting the occurrence of cigar Fusarium root rot. Overall， reducing soil capillary porosity and the relative abundance of Fusarium， increasing soil aeration porosity and the relative abundance of Pseudobensingtonia were conducive to the prevention and control of cigar Fusarium root rot.

Keywords： cigar; Fusarium root rot; fungus; physical and chemical properties; correlation analysis

镰刀菌（Fusarium spp.）是一种在自然界广泛分布的土传真菌类病原菌，可侵染多种植物，导致植株根腐、茎腐、穗烂等[1-2]，在我国云南、河南等烟区普遍发生[3-4]，严重影响烟叶产质量。近些年，随着雪茄烟种植规模的不断扩大，根腐病给雪茄烟造成的损失逐渐受到人们的关注[5]。

土壤-微生物-作物系统失调产生的土壤生态环境恶化、微生物区系失衡、植物抗病能力降低是烟草病害发生的主要因素[6]。有研究认为烟草镰刀菌根腐病的发生主要受湿度、温度和土壤 pH 的影响[7]，土壤含水量过高，发病较重。MEYER 等[8]研究表明土壤 pH 对根腐病发病有重要影响，pH 高于5.6有利于病害的发生和蔓延，pH 低于5.2时则很少发病。当前关于烟草根腐病影响因素的研究多集中在烤烟区的气候及栽培模式[9]、防控措施[10]等方面，关于雪茄烟镰刀菌根腐病病情指数与土壤真菌群落和理化性状的相关性研究鲜有报道。为此，本文通过对根际土壤真菌扩增子测序和土壤理化指标分析，研究来凤县雪茄烟区镰刀菌根腐病发病与未发病根际土壤真菌群落和土壤因子的差异及其与病情指数的相关性，以期明确影响根腐病发生的关键因素，为当地雪茄烟根腐病的防控提供理论依据。

1材料与方法

1.1样品采集与制备

取样地点为湖北来凤县漫水乡桶子村、百福司镇拦河村等雪茄烟叶种植区域。土壤类型为黄棕壤，肥力水平中等，雪茄烟品种为 CX80。在2021年9—10月雪茄烟叶采收结束后，在相同发病程度的烟株垄体中间去除1～2 cm 表层土后，进行环刀样采集[11]，用于土壤物理指标测定；并拔出烟株茎秆及根系，采用抖动法采集镰刀菌根腐病发病和未发病根际土壤，用于土壤化学性状测定和真菌 ITS1测序。根腐病发病等级参考国家标准 GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》调查确定。病情指数=Σ（各级病株数×该级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）×100。采集未发病土壤样品10个，用 SH 表示；发病土壤样品10个，用 SD 表示。

1.2土壤理化性状测定项目与方法

土壤 pH、有机质（SOC）、碱解氮（AN）、有效磷（AP）、速效钾（AK）、有效氯（ACl）、交换性钙（ECa）、交换性镁（EMg）、有效硼（AB）、有效铜（ACu）、有效钼（AMo）、有效锌（AZn）、有效锰（AMn）、有效铁（AFe）等参考鲍士旦[12] 的方法进行测定。土壤容重（SBD）、含水量（SAWC）、总孔隙度（STP）、毛管孔隙度（SCM）、通气孔隙度（SAP）采用环刀烘干法测定[13]。

1.3土壤真菌的检测

采用CTAB 法对样本的基因组DNA 进行提取，再利用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和浓度，取适量样品，用无菌水稀释樣品至1 ng/μL。利用 ITS5-1737F （5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG-3′）和 ITS2-2043R （5′-GCTGCGTTCTTCA TCGATGC-3′）引物对土壤真菌 ITS1区进行 PCR （Bio-rad  T100梯度 PCR 仪）扩增。扩增体系为30μL：15μL Phusion Master Mix （2×）、3μL 的 Primer （2μmol/L ）、10μL 的 gDNA（1 ng/μL）、2μL的 H2O。反应程序：98 C预变性1 min；98 C 10 s，50 C 30 s，72 C 30 s，30个循环；72 C，5 min 。扩增后的 PCR 产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测。使用 New England Biolabs 公司的 NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina 建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测，合格后，由北京诺禾致源科技股份有限公司使用 HiSeq 进行上机测序[14]。

1.4数据分析

对相似度≥97%的序列进行 OTUs 的聚类，对聚类的序列开展物种的注释，用 Mothur 软件与 SILVA 的 SSUrRNA 数据库进行物种的注释分析。对 OTU 表中各样品的数据进行均一化处理，用 Origin8.5软件绘制稀释曲线，用软件 Qiime Version 1.9.0对 Alpha 多样性进行分析，Shannon 指数和 Simpson 数越大表示群落多样性越高， Observed_species、Ace 指数和 Chao1指数越大表示群落丰富度越高。采用 Excel 2007、SPSS Statistics 26软件进行数据分析，差异显著性应用 LSD 法开展多重比较，数据用平均值±标准差表示。

2结果

2.1镰刀菌根腐病发病状况分析

雪茄烟田镰刀菌根腐病的发病状况见图1。病情指数为0的土样有10个，为未发病土壤；病情指数大于0的土样有10个，平均病情指数为79.60，为发病土壤。

2.2土壤真菌群落 Alpha 多样性分析

微生物 ITS 测序结果显示（图2），未发病和发病根际土壤的平均 Goods_coverage 达到0.9932和0.9955，表明测序深度基本覆盖到未发病和发病土壤样品中所有的真菌物种。从 Observed_species 稀释曲线可以看出，随着测序量的增加，真菌物种数量先急剧增加再趋于平缓，说明测序数量合理，可以反映土壤真菌绝大部分的序列信息。

由图3可知，相对于未发病根际土壤，根腐病发病土壤真菌群落的 Observed_species 、Shannon、 Chao1和 Ace 指数分别降低了63.7%、28.6%、68.2%和61.3%，达极显著水平（p<0.01）， Simpson 指数降低了5.6%，达显著水平（p<0.05）。上述表明镰刀菌根腐病的发生显著降低了根际土壤真菌数量和群落结构的多样性。

2.3土壤优势真菌属差异分析

对相对丰度前十的优势真菌属进行群落差异分析。由表1可知，较未发病土壤，发病根际土壤的拟本森顿酵母菌（Pseudobensingtonia）相对丰度降低了88.9%，达极显著水平（p<0.01），镰刀菌（Fusarium）相对丰度增加了41.3%，达显著水平（p<0.05）；毛霉菌（Mucor）、赤霉菌（Gibberella）、毛盘孢菌（Colletotrichum ）的相对丰度增加了157.9%、103.0%、1900.0%，孢霉菌（Mortierella）、锥盖伞属（Conocybe）的相对丰度降低了25.2%、91.7%，但差异均未达到显著水平。相关性分析表明， Fusarium 与 Mortierella 、Gibberella 相对丰度分别呈极显著负相关（r=–0.663，p<0.01）和显著正相关关系（r=0.454，p<0.05）；根腐病病情指数与 Pseudobensingtonia 、Fusarium 相对丰度分别呈极显著负相关（r=?0.586，p<0.01）和极显著正相关关系（r=0.610，p<0.01）。

2.4土壤理化性状分析

由表2可知，根腐病发病土壤速效钾、含水量、毛管孔隙度和通气空隙度为329.0 mg/kg 、18.29%、29.93%、19.86%，较未发病土壤分别提高123.0 mg/kg、2.44%、5.46%和降低6.63%，均达显著水平（p＜0.05），其他指标差异不显著。相关性分析表明，雪茄烟根腐病病情指数与土壤含水量（r=0.603，p ＜0.01）和毛管孔隙度（r=0.729，p ＜0.01）极显著正相关，与土壤速效钾含量（r=0.508，p ＜0.05）显著正相关，与土壤通气孔隙度极显著负相关（r=?0.591，p ＜0.01）。

2.5典型相关分析

选择与病情指数相关性显著（p＜0.05）的4个土壤理化指标（土壤含水量、毛管孔隙度、通气孔隙度、速效钾含量）及2个真菌指标（Fusarium 和 Pseudobensingtonia 相对丰度）开展典型相关分析（图4），并结合 OTUs 矩阵构建典型相关模型（p ＜0.05）。未发病与发病根际土壤真菌群落分离较好，两个排序轴共解释了45.80%的土壤真菌群落结构的变化。土壤含水量、毛管孔隙度、速效钾含量和 Fusarium 相对丰度对发病土壤真菌群落有较大影响，有利于土壤根腐病发生的真菌群落构建，导致病害的加剧；土壤通气孔隙度和 Pseudobensingtonia 相对丰度对未发病土壤真菌群落有较大影响，其增加有利于土壤防控根腐病真菌群落的构建，从而抑制病害发生。根据图中箭头长度可以看出，毛管孔隙度对真菌群落结构影响较大，其次为通气孔隙度。

3討论

微生物是评价土壤生态系统的重要指标，能有效反映土壤质量和生态功能的变化[15]。微生物的组成和数量对土壤的抑病性有显著影响[16]，其群落多样性与植物对抗病原菌的综合能力正相关[17]。本文中雪茄烟镰刀菌根腐病的发生降低了根际土壤真菌数量和群落多样性，显著增加了病原菌 Fusarium 的相对丰度，与郑元仙等[18]在烤烟上的研究结论相似，表明雪茄烟镰刀菌根腐病的发生与根际土壤微生物群落结构失衡、病原菌相对丰度增加、根际微群落转化为病理组合等因素有直接关系[19]。

根际土壤中存在着大量的病原菌及病原菌拮抗微生物[20]。雪茄烟镰刀菌根腐病的发生，显著增加了Fusarium 相对丰度、降低了Pseudobensingtonia 相对丰度。Fusarium 是一种在土壤中繁殖较快的病原菌，其产生的毒素引起的植物根腐病，是作物减产、绝产的关键因素[21]，是烟草镰刀菌根腐病发生的重要致病菌[22]。Pseudobensingtonia 属于担子菌门、伞型束梗孢菌纲的酵母菌类，未见其对植物致病的相关报道[23]。Mortierella 是雪茄烟田根际土壤中优势真菌属（表1），本研究表明根际土壤中 Mortierella 与 Fusarium 极显著负相关（r=?0.663，p ＜0.01），可能是 Mortierella 、Pseudobensingtonia等通过影响土壤真菌丰度和群落组成[24]以及采取生态位竞争等方式，间接抑制了致病菌 Fusarium 的繁殖，进而降低了雪茄烟根腐病的病情指数，具体的影响机制还有待进一步研究。Gibberella 属于子囊菌门粪壳菌纲肉座菌目丛赤壳科赤霉属，目前相关研究并未发现 Gibberella 对烟草有直接致病性[25]，但 Gibberella 会导致赤霉病危害水稻、小麦、大麦、玉米等禾谷类作物[26]。本研究中 Gibberella 与 Fusarium 呈显著正相关（r=0.454，p ＜0.05），可能根际土壤中 Gibberella 与 Fusarium 具有协同效应，间接导致雪茄烟镰刀菌根腐病的加重。

理化性状是土壤重要的非生物因素，能直接影响根腐病致病菌 Fusarium 的生长[27-28]。本文中雪茄烟根腐病病情指数与土壤通气空隙度显著负相关，说明提高通气空隙度可能有利于雪茄烟镰刀菌根腐病的防控。本研究通过相关性分析得出 Fusarium 相对丰度与土壤含水量（r=0.580，p ＜0.01）、毛管空隙度（r=0.586，p ＜0.01）极显著正相关，说明土壤含水量和毛管孔隙度的增加，有利于 Fusarium 的繁殖，是导致雪茄烟镰刀菌根腐病发病严重的重要因素之一[10]。土壤速效钾含量对真菌群落结构及多样性有较大的影响[29]，左丽娟等[30]研究表明传统施肥中，增施钾肥能显著提高烟草的根腐病抗性。但本文中速效钾含量与雪茄烟镰刀菌根腐病的病情指数显著正相关，可能是取样区域的雪茄烟田速效钾含量较高，导致土壤钙镁等流失[31]，土壤团粒结构下降，通透性变差、通气空隙度降低，土壤含水量偏高，导致雪茄烟根系不发达，进而降低了对镰刀菌根腐病的抵抗能力。

4结论

本研究表明，相对于未发病土壤，雪茄烟镰刀菌根腐病的发生明显降低了根际土壤真菌数量和群落结构的多样性，极显著降低了 Pseudobensingtonia 相对丰度，显著增加了Fusarium 相对丰度。 Fusarium 与 Mortierella 、Gibberella 相对丰度分别极显著负相关和显著正相关。根腐病病情指数与土壤含水量、毛管孔隙度、速效钾含量和 Fusarium 相对丰度显著正相关，与土壤通气孔隙度和 Pseudobensingtonia 相对丰度显著负相关。典型相关分析表明，土壤含水量、毛管孔隙度、速效钾含量和 Fusarium 相对丰度对根腐病发病土壤的真菌群落有较大影响，土壤通气孔隙度和 Pseudobensingtonia 相对丰度对未发病土壤真菌群落有较大影响。因此，来凤县雪茄烟区可综合采取改良土壤物理结构、平衡土壤养分、改善微生物群落组成等措施，降低土壤含水量、速效钾和有害菌群（Fusarium 等）相对丰度，提高土壤通透性和 Pseudobensingtonia、Mortierella 相对丰度，达到防控雪茄烟镰刀菌根腐病的目的。

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