关节腔内注射滇白珠醇提取液治疗急性痛风性关节炎的实验研究*

姚文琴,覃云璐,党荣敏,王 恒,邓 莹,王定瑜

黔南民族医学高等专科学校,贵州都匀 558003

急性痛风性关节炎是由单钠尿酸盐沉积在关节囊、滑囊、软骨、骨质和其他组织中所致的晶体相关性关节病。越来越多的证据表明,代谢-免疫-炎症是一个相互影响的复杂“网络”,“网络”中各种分子间相互作用,导致疾病发生、发展[1]。目前痛风性关节炎的治疗主要包括缓解发作时疼痛和抑制炎症反应,常用药物为非甾体消炎药、秋水仙碱、糖皮质激素等,药物不良反应大。杜鹃花科植物滇白珠的茎叶性热、味辛辣,属热药,入冷经,其根、梗具有活血化瘀、祛风除湿作用,可治疗风寒湿痹、筋骨疼痛[2]。滇白珠的化学成分类型主要有黄酮类、萜类、水杨酸甲酯糖苷类、木脂素类、香豆精类、有机酸类和甾体类,还含有香豆素、生物碱等[3],具有镇痛、抗炎、抗病毒作用。临床常见含滇白珠的复方成药有痛风灵、滇白珠糖浆、复方伸筋胶囊等,多用于急性痛风性关节炎、类风湿关节炎、跌打损伤和湿疹等方面的治疗[4]。滇白珠是贵州苗族民间治疗痛风的常用药材,有研究报道采用灌胃治疗效果突出[5-6]。本研究采用大鼠关节腔内注射滇白珠醇提取液的新治疗手段,观察其治疗作用并分析作用机制,为临床用药、开发新药、扩大新药源提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级SD雄性大鼠50只,体质量250～270 g,购自贵州医科大学实验动物中心,合格证号:SCXK(黔) 2018-0001。滇白珠购自贵州省都匀市药材市场,经黔南民族医专药学系鉴定为杜鹃花植物滇白珠。

1.2仪器与试剂 尿酸钠结晶(Sigma公司,规格:5 g,批号:102306692);大鼠白细胞介素(IL)-17、血管内皮生长因子 (VEGF)、IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号:201904);酶标仪(北京凯奥K6600A)。

1.3方法

1.3.1滇白珠醇提取液的提取 药物提取采用醇提法,提取方法如下:称取滇白珠粗粉74 g置于100 mL圆底烧瓶中加70%乙醇800 mL,水浴加热1 h,减压过滤,取滤渣置于原烧瓶内加70%乙醇700 mL,再次水浴加热1 h后减压过滤,合并两次提取液,减压浓缩到无醇味,分别取一定体积配制成浓度(相当于原药材)为4、2、1 g/mL储备液备用。

1.3.2动物分组 50只SD大鼠按随机数字表法分为5组,每组10只,分别设空白对照组、模型组及滇白珠醇提取液治疗高剂量组(4 g/kg)、中剂量组(2 g/kg)、低剂量组(1g/kg)。

1.3.3模型的建立与实验干预 取 500 mg单钠尿酸盐晶体,加 2 mL 吐温80,再加入无菌生理盐水后用磁力搅拌器加热搅拌,直至晶体完全溶解,定容至 20 mL,制成 25 mg/mL单钠尿酸盐晶体混悬液,高压灭菌后,于4 ℃ 保存,用前摇匀。SD 大鼠适应性喂养1周,参照文献[7]造模方法,水合氯醛麻醉后以大鼠右后肢背侧正中踝关节与胫腓骨之间的关节腔为进针点,将踝关节摆放成直角,充分暴露踝关节与胫腓骨的间隙,注射针头与胫骨成45°夹角插入关节腔,模型组及滇白珠醇提取液各剂量组均注射0.2 mL 25 mg/mL单钠尿酸盐晶体混悬液制备急性痛风性关节炎模型。造模成功后,滇白珠醇提取液高、中、低剂量组分别给予4、2、1 g/kg滇白珠醇提取液0.2 mL关节腔内注射,模型组以同样方法仅注射 0.2 mL无菌生理盐水,均连续给药 1周。空白组不予任何处理。

1.3.4指标检测 模型组造模第7 天,滇白珠醇提取液各剂量组末次给药1 h 后,取各组大鼠股动脉血,静置,2 000 r/min离心15 min,取上清液,在-20 ℃ 下保存待测。采用ELISA检测血清 IL-17、VEGF、IL-6水平。

病理检查:剪取踝关节置10%甲醛液中固定脱钙,梯度乙醇脱水,将透明处理后的组织块放入已溶化石蜡内浸蜡包埋、切片,干燥待染。将石蜡切片脱蜡、水洗后HE染色镜检。光学显微镜下观察大鼠踝关节滑膜炎症与程度及关节软骨细胞等情况。炎症细胞浸润评分标准[8]:无炎症,计0分;轻度炎症,可见少量白细胞浸润,计1分;中度炎症,可见2个或以上的白细胞聚集物,计2分;重度炎症,出现白细胞融合及浸润显著,计3分。

2 结 果

2.1各组大鼠血清IL-17、VEGF、IL-6水平比较 与模型组相比,滇白珠醇提取液不同剂量组血清中IL-17、VEGF、IL-6水平均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),滇白珠醇提取液中、高剂量组血清IL-17、VEGF、IL-6水平均低于滇白珠醇提取液低剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05);滇白珠醇提取液高剂量组血清IL-17、VEGF水平与滇白珠醇提取液中剂量组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。滇白珠醇提取液高剂量组血清IL-6水平低于滇白珠醇提取液中剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-17、VEGF、IL-6水平比较

2.2急性痛风性关节炎大鼠踝关节病理检查结果 病理检查结果显示:滇白珠醇提取液不同剂量组与模型组比较,局部血管内有较多中性粒细胞,上皮及皮下充血明显。滇白珠醇提取液低剂量组纤维组织及滑膜轻度增生;滇白珠醇提取液中剂量组较多淋巴细胞、浆细胞浸润,色素沉着,滑膜轻度增生;滇白珠醇提取液高剂量组肉芽组织增生,大量淋巴细胞、浆细胞浸润,滑膜未见增生,关节软骨及骨组织结构形态正常,未见痛风结节。见图1。

注:A为空白对照组;B为模型组;C为滇白珠醇提取液低剂量组;D为滇白珠醇提取液中剂量组;E为滇白珠醇提取液高剂量组。图1 踝关节组织病理检查结果(HE染色,×200)

3 讨 论

急性痛风性关节炎是临床常见病,发作时严重影响患者的日常生活,如不积极治疗极易致残、致畸,影响关节功能。急性痛风性关节炎发病的免疫学机制涉及多条与炎症相关的信号通路,即Toll样因子受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)依赖性核因子-κB 信号通路、Nod 样受体蛋白 3 炎性小体、脂联素、三磷酸腺苷(ATP)-P2X7R 信号通路等,关节滑膜炎症因子及其组成的滑膜免疫微环境在急性痛风性关节炎发病过程中占有重要地位,它们可通过多个信号通路介导痛风的发病[9]。

痛风性关节炎急性期多采用秋水仙碱、非甾体消炎药进行抗炎止痛对症治疗,但存在胃肠反应及肝肾功能损害等不良反应。中医认为“浊瘀”是痛风的发病病机,使用祛湿化浊或祛湿化瘀药可缓解。我国天然物产资源丰富,作为安全、有效的天然抗急性痛风性关节炎制剂的药用植物研发必将取得突破性进展,潜藏着巨大的开发价值。肖壮等[10]研究证实滇白珠具有抗炎镇痛、抑菌、抗氧化及抑制炎症介质产生与分泌的作用。天然药物治疗急性痛风性关节炎给药方式多数为口服,关节腔内注射是目前临床用于骨、关节疾病治疗的常用方法,可用于缓解关节肿痛、损伤[11-12]。采用不同剂量滇白珠醇提取液关节腔注射治疗急性痛风性关节炎,通过将药物直接输送到炎症部位,改变药物在体内的分布模式,避开了药物在体内转运过程中必经的生理屏障,以最小的剂量发挥最大的作用。

急性痛风性关节炎模型中单钠尿酸盐晶体沉积在关节、滑膜引起炎症应激反应,核因子NF-κB信号传导可调节大量活化的吞噬细胞、Th细胞亚群等炎症细胞分泌细胞因子,产生炎症级联反应。有研究显示血清 VEGF、IL-17、IL-6水平可以作为判断急性痛风性关节炎病情严重程度的重要指标[13-14]。本实验观察关节腔内注射不同剂量滇白珠醇提取液对急性痛风性关节炎大鼠的治疗作用及对血清IL-17、VEGF、IL-6水平的影响,结果显示与模型组比较,滇白珠醇提取液不同剂量组血清中IL-17、VEGF、IL-6水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。滇白珠醇提取液中、高剂量组血清IL-17、VEGF水平均低于滇白珠醇提取液低剂量组(P<0.05),而滇白珠醇提取液高剂量组血清IL-17、VEGF水平与滇白珠醇提取液中剂量组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。滇白珠醇提取液低、中、高剂量组血清IL-6水平两两组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。分析其原因可能是因为滇白珠醇提取液关节腔内注射后,下调血液中VEGF水平,VEGF作为直接作用于血管内皮细胞的有丝分裂原,其促进新生血管的形成能力及血管的通透性显著下降,血管内物质的渗出减少,同时Th17细胞分泌产生的IL-17减少,抑制炎症介质的产生与分泌。IL-6 是一种多功能炎症细胞因子,不仅可以直接参与炎症反应,同时也可以促进其他炎症因子的释放,加强炎症反应,在痛风性关节炎发病过程中扮演重要角色。IL-6水平降低后,导滑膜炎症反应和软骨破坏减轻,可能与在炎症局部直接发挥抗炎作用有关,炎症的形成和发展受到抑制。病理结果也证实,滇白珠醇提取液不同剂量组与模型组比较,局部血管内有较多中性粒细胞,上皮及皮下充血明显;滇白珠醇提取液低剂量组纤维组织及滑膜轻度增生;滇白珠醇提取液中剂量组较多淋巴细胞、浆细胞浸润,色素沉着,滑膜轻度增生;滇白珠醇提取液高剂量组肉芽组织增生,大量淋巴细胞、浆细胞浸润,滑膜未见增生,关节软骨及骨组织结构形态正常,未见痛风结节。

综上所述,本实验研究结果显示关节腔内注射滇白珠醇提取液对急性痛风性关节炎有治疗效果,呈现剂量依赖,可能与下调血清IL-17、VGEF、IL-6等炎症因子水平有关,但确切的作用机制还有待进一步研究。