血清外泌体miR-486-3p对非小细胞肺癌早期诊断价值

王琳娜 王静

［摘要］ 目的 分析血清外泌体miR－486－3p对非小细胞肺癌的早期诊断价值。

方法 选择非小细胞肺癌病人120例为观察组，同期体检健康志愿者120例为对照组，均采集空腹静脉血，磷钨酸钠溶液染色后采用透射电镜观察外泌体形态，Western blot方法检测外泌体标志性蛋白CD81、TSG101表达，实时荧光定量PCR（RT－qPCR）方法检测miR－486－3p水平，采用化学发光法检测血癌胚抗原（CEA）、糖类抗原125（CA125）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、细胞角蛋白19片段（CYFRA21－1）水平，绘制受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析血清外泌体miR－486－3p诊断非小细胞肺癌的灵敏度和特异度。

结果 透射电镜观察可见，外泌体呈盘状囊泡样结构，直径为20～300 nm，颗粒状。Western blot实验鉴定表面标志蛋白CD81、TSG101证实为外泌体。观察组血清CEA、CA125、NSE、CYFRA21－1水平均高于对照组（t=10.701～31.406，P<0.01），miR－486－3p水平低于对照组（t=17.155，P<0.01）；观察组高龄、男性、有淋巴转移病灶及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人的miR－486－3p表达水平均低于中青年、女性、无淋巴转移性病灶及TNM分期Ⅰ～Ⅱ期病人（t=8.168～19.658，P<0.05）。ROC曲线分析显示，血清外泌体miR－486－3p诊断非小细胞肺癌的曲线下面积（AUC）为0.781，95%置信区间（CI）为0.724～0.839，灵敏度为51.67%，特异度为98.33%，最佳界值为0.945。

结论 血清外泌体miR－486－3p对非小细胞肺癌具有一定的早期诊断价值，血清外泌体miR－486－3p表达水平越低，非小细胞肺癌病人恶化程度越高。

［关键词］ 血清；外泌体；miR－486－3p；癌，非小细胞肺；癌症早期检测

［中图分类号］ R730.4

［文献标志码］ A

［文章编号］ 2096－5532（2023）02－0292－04

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.068

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

球范围内恶性肿瘤死亡的常见原因之一。非小细胞肺癌是肺癌中最常见的病理类型，其早期诊断具有一定的难度，且5年生存率较低。肺癌发病早期多无典型临床表现，一经发现往往已经发展至中晚期，预后不佳。外泌体天然存在于人体体液中，其成分中含有mRNA、miRNA和蛋白质等能够携带重要生物信息的分子，肿瘤源性或肿瘤相关的外泌体含有丰富的生物成分，可作为信号信使参与前列腺癌发生、发展、进展和转移过程中细胞间通讯，是调节微环境的重要递质。由于这些外泌体可以从各种体液中分离出并检测到，已成为肿瘤诊断和预后有潜力的新的生物标记物。miRNA是一种非编码小分子RNA，可调节细胞的增殖、分化和凋亡，在肿瘤的诊断、预后和治疗中发挥重要作用。外泌体中的miRNA－486－3p在很多恶性肿瘤中均呈现异常表达，如肝癌、胰腺癌、肺癌或胰腺癌等。本研究通过检测并分析非小细胞肺癌病人和健康体检者血清外泌体miR－486－3p表达水平差异，探究血清外泌体miR－486－3p对非小细胞肺癌的早期诊断价值。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2018年10月—2020年9月，选取本院收治的非小细胞肺癌病人120例为观察组，以同期本院体检的健康志愿者120例为对照组。观察组男93例，女27例；年龄40～79岁，平均（59.87±10.39）岁。病人纳入标准：①经影像学及病理检查确诊为非小细胞肺癌；②意识清楚，无精神系统疾病，认知正常，能够通过语言或行为与他人正常交流。排除标准：①肝肾功能严重不全者；②免疫系统疾病病人；③合并其他恶性肿瘤者；④除肺部以外其他恶性肿瘤病人。对照组男95例，女25例；年龄38～80岁，平均（60.34±11.27）岁。所有对照组受试者影像学检查、实验室检测均未见明显异常；意识清醒，无精神系统疾病。所有研究对象知情同意且研究通过本院伦理委员会审核批准。

1.2 检测指标及方法

采集两组受试者空腹静脉血5 mL，以4 000 r/min离心15 min，获取血清，应用Auto 2000发光仪（美国，SBI公司）检测血清中癌胚抗原（CEA）、糖类抗原125（CA125）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）及细胞角蛋白抗原片段21－1（CYFRA21－1）水平。应用Exo Quick－TM试剂（美国，SBI公司）提取血清外泌体，按照试剂说明书操作。用磷钨酸溶液染色法染色后，透射电镜（Olympus）观察外泌体颗粒形态，纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术测定外泌体粒径大小。应用Western blot法检测外泌体表面蛋白标志物CD81和TSG101表达，实时荧光定量PCR（RT－qPCR）方法检测miR－486－3p水平。收集受试者一般资料，对病人手术后肿瘤组织病理学、肿瘤病灶最大直徑等进行分析。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism9软件进行统计学处理。计量资料结果以±s表示，组间比较采用t检验；计数资料用百分比或例数表示，数据间比较采用χ2检验；P<0.05表示差异有统计学意义。应用 MedCalc 15.2.2 软件绘制受试者工作特征 （ROC）曲线，分析血清外泌体miR－486－3p诊断非小细胞肺癌的灵敏度和特异度。

2 结果

2.1 血清外泌体的鉴定

透射电镜观察显示，外泌体具有脂质双层囊泡结构（图1）；NTA 技术观察结果显示，外泌体颗粒直径呈单峰正态分布，峰值处颗粒直径约为 90 nm，颗粒主要分布于20～300 nm（图2）。Western blot检测显示，外泌体表达CD81和TSG101表面标志蛋白（图3）。

箭头所示为外泌体，磷钨酸溶液染色法染色，放大70 000倍。

2.2 两组血清检测指标比较

观察组血清CEA、CA125、NSE和CYFRA21－1水平均高于对照组（t=10.701～31.406，P<0.01），观察组血清外泌体miR－486－3p水平显著低于对照组（t=17.155，P<0.01）。见表1和图4。

2.3 不同病理特征非小细胞肺癌miR－486－3p表达比较

观察组高龄、男性、有淋巴转移性病灶及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人的miR－486－3p表达水平均低于中青年、女性、无淋巴转移性病灶及TNM分期Ⅰ～Ⅱ期病人（t=8.168～19.658，P<0.05），而组织学诊断差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.4 miR－486－3p对非小细胞肺癌的诊断效能评估

ROC曲线分析显示，血清外泌体miR－486－3p诊断非小细胞肺癌的曲线下面积（AUC）为0.781，95%置信区间（CI）为0.724～0.839，诊断的灵敏度为51.67%，特异度为98.33%，最佳界值为0.945（图5）。

3 讨论

肺癌在临床上发病率较高，其病死率居恶性肿瘤首位，其中非小细胞肺癌病人占80%以上。很多病人在明确诊断时往往已经发展至中晚期，若早期明确诊断，采取手术等措施綜合治疗，5年生存率能够显著提高。CEA、CA125、NSE、CYFRA21－1等肿瘤标志物是常见的肺癌筛查指标，但其灵敏度、特异度均较低，无法满足临床需求。低剂量螺旋CT具有发现早期病灶的能力，但却容易引起医生对疾病的误判，导致进行一些不必要的治疗；另外，频繁的CT检查也对病人的健康不利。其他检查，如支气管病理活检，属于有创检查，病人接受难度较高，对于早期非小细胞肺癌病人的诊断价值比较有限。因此，寻找特异度及灵敏度更高的检测方法是肺癌筛查的目标。

外泌体的本质是一种细胞外囊泡，其体积较小，直径通常介于20～300 nm范围内，它们主要由细胞分泌产生，并通过胞吐的方式释放进入各种体液，外泌体可在血液、尿液、汗液以及脑脊液等多种体液中存在。Exocarta数据库显示，已经发现的外泌体超过万种，在各种外泌体中，其组成成分包括蛋白质、mRNA、miRNA以及脂质。这些成分是体内新陈代谢的重要物质，参与体内的物质交换，因此它们在肿瘤发生的早期即可出现一定的变化，对肿瘤早期诊断以及治疗后病情的评估都有着重要的意义，已成为肿瘤血清生物标记研究的热点。

本文研究主要检测血清外泌体中的miRNA。miRNA属于非编码RNA，能够通过mRNA的靶向互补作用而达成对基因表达的调控作用。目前研究认为，miRNA在肿瘤发生发展及转移的过程中有一定的临床作用，这也是癌症治疗中的新思路。有研究表明，miRNA在恶性肿瘤病人体内多呈异常表达，与多种恶性肿瘤病人的预后关系密切，具有一定的早期诊断价值。本文结果显示，观察组血清CEA、CA125、NSE、CYFRA21－1的水平均高于对照组，而血清外泌体miR－486－3p水平低于对照组，提示检测肿瘤标志物能一定程度筛选出肺癌病人。

TNM是分析肺癌的病理类型、浸润程度等方面的常用分型方式。本文研究结果显示，观察组高龄、男性、有淋巴转移性病灶及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人的miR－486－3p表达水平均低于中青年、女性、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴转移性病灶者。提示肿瘤细胞恶化程度越高，miR－486－3p表达水平可能越低。

综上所述，非小细胞肺癌在肺癌中比较常见，预后较差，早期诊断并及时予以治疗措施，能够延长病人生存时间。血清外泌体miR－486－3p属于常见抑癌miRNA，在非小细胞肺癌中呈现低水平表达，且非小细胞肺癌病人恶化程度越高，血清外泌体miR－486－3p表达水平越低，二者之间呈负相关，提示血清外泌体miR－486－3p对非小细胞肺癌具有一定的早期诊断价值。外泌体miRNA是外泌体的重要组成部分，在机体免疫、疾病进展，尤其是肿瘤的发生、发展、变化中都有参与。但是目前，临床上对于外泌体的研究还处于基础阶段，在理论体系方面尚不完善，并且在科研投入和技术支持方面都存在一定的欠缺，有待进一步深入。外泌体中的很多组成部分均有望成为疾病的无创生物标志物，为疾病的早期发现、预后评估提供可靠的临床依据。

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（本文编辑 黄建乡）