实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的构建*

谢文娟，赵雅妮，龙雪麟，李淑蓉，苏炳银△，谭泓琳△

1.成都医学院 发育与再生四川省重点实验室（成都 610500）；2.成都医学院 组织学与胚胎学教研室（成都 610500）；3.成都医学院 病理与病理生理学教研室（成都 610500）

多发性硬化症（multiple sclerosis， MS）是一种中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病，常累及脑、脊髓和视神经，其主要病理特征包括脱髓鞘、轴突损伤及神经炎症[1]。MS发病年龄在20～40 岁，是青壮年致残的主要疾病之一[2]。目前，MS的病因和发病机理尚未明确，由于MS患者的脑组织标本不易获取，限制了对该疾病的基础和临床研究，因此构建合适的动物模型十分必要。

目前常用的MS模型包括实验性自身免疫性脑脊髓 炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）、铜螯合剂-新铜试剂等毒素诱导的脱髓鞘模型和小鼠脑脊髓炎病毒模型，其中EAE模型与人类疾病十分相似，因此在科研中应用广泛，其原理是给动物体内注射某些抗原物质，引起机体免疫系统识别异常，从而导致髓鞘、轴突等结构的免疫性损伤。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）虽然只占髓鞘总蛋白的0.05%左右，但由于其在少突胶质细胞膜上表达，因此具有很强的免疫原性[3]。MOG35-55是MOG细胞膜表面致脑炎的抗原决定簇之一，其敏感小鼠品系为C57BL/6J小鼠[4]，该品系在国内常见且遗传背景清晰。

本研究以MOG35-55作为抗原两次免疫C57BL/6J小鼠，同时注射百日咳毒素（pertussis toxin， PTX）制备EAE模型，通过临床症状评分和组织病理学检测分析模型是否构建成功，以期为进一步研究MS的发病机制、病理过程及药物开发提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级8 周龄C57BL/6J雌性小鼠，体重18～20 g，20 只，购于成都达硕实验动物有限公司，按随机数字表法分为EAE组和对照组，每组10只。所有小鼠按照SPF级标准饲养，环境要求如下：室内温度18 ℃～29 ℃，相对湿度40%～70%，气流速度≤0.18 m/s，新鲜空气换气次数10次/h，洁净度10000级，氨浓度15 mg/m32，光照度150～300 Lux，噪声≤60 dB。实验小鼠正常进食、饮水，定期更换垫料、饮水等。

1.2 试剂与仪器

MOG35-55多肽由上海生物工程有限公司合成（货号：T510219），经质谱分析纯度＞ 97%；卡介苗灭活冻干粉购自上海晶诺生物科技有限公司（货号：GOMY0147）；不完全弗氏佐剂（incomplete Freund's adjuvant， IFA）购自上海sigma-Aldrich公司（货号：F5506）；PTX购自上海sigma-Aldrich公司（货号：P7208）；髓鞘碱性蛋白抗体（anti-myelin basic protein， Anti-MBP）购自美国Millipore公司（货号：NE1019）；小胶质细胞特异性标志物抗体（Anti-Iba1）购于上海Abcam公司（货号：ab178847）；Anti-Mouse IgG（货号：31160）、Anti-Rabbit IgG（货号：31210）购自美国Invitrogen公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）购自安徽biosharp生物科技有限公司（货号：BS114）；曲拉通X-100（Triton X-100）购自上海生工生物工程股份有限公司（货号：A600198）；Black-Gold Ⅱ染色试剂盒购自上海sigma-Aldrich公司（货号：AG105）。

倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司（型号：BX-63）；脱色摇床购自太仓市华利达实验设备有限公司（型号：ZD-9556）；冰冻切片机购自美国Thermo公司（型号：CM1950）。

1.3 试剂配制

抗原乳剂：将100 mg卡介苗灭活冻干粉加入到10 mL IFA中，使之成为完全弗式佐剂（complete Freund's adjuvant，CFA）；4 mg MOG35-55多肽溶于1.33 mL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS），即配制浓度为3 g/L的多肽液；MOG35-55多肽液（3 g/L）与CFA按1∶1比例混合，用注射器反复推拉乳化，制成“油包水”的抗原乳剂。PTX溶液：50 μg PTX溶于1 mL PBS，配制成50 mg/L的PTX储备液，使用浓度为1 mg/L。

1.4 EAE 的构建

EAE组小鼠在双侧腹股沟及后肢分4 点皮下注射，每点注射50 μL乳剂。于首次免疫后0、48 h腹腔注射PTX （1 mg/L）200 μL，6 d后在相同部位注射相同剂量抗原乳剂加强免疫。对照组小鼠在双侧腹股沟及后肢分4 点皮下注射不含MOG35-55多肽的CFA，其余实验方法均与EAE组相同。

1.5 神经功能评分

建模后，根据Kelero等[5]提出的神经功能评分标准，课题组成员每天观察两组小鼠行为学变化，并对小鼠的神经功能进行评分（表1）。

表1 小鼠神经功能评分（分）

1.6 组织取材与检测

1）取材：在EAE组小鼠症状较严重时（免疫后第19 天），腹腔注射4%水合氯醛对小鼠进行麻醉，使用消毒灭菌后的手术器械，快速打开小鼠胸腔，充分暴露心脏，经左心室灌注1×PBS充分洗净组织中的血液，观察肝脏颜色变白后改用4%多聚甲醛灌注，充分固定后立即取出小鼠的大脑和脊髓组织，放入4%多聚甲醛液中进行后固定，固定好的组织进行梯度脱水，OCT包埋并冰冻切片（20 μm）。2）免疫组织化学染色：切片置于PBS复水，随后滴加封闭液（5% BSA + 1.5% Triton X-100+1×PBS）于37 ℃孵育60 min；滴加Anti-MBP、Anti-Iba1 抗体（1∶500）， 4 ℃孵育过夜；PBS清洗3 次后，滴加DyLight 488 标记的山羊抗兔二抗（1∶200），室温孵育1.5 h；PBS清洗3 次后，使用含DAPI的抗荧光淬灭剂进行封片，荧光显微镜下观察及拍照。3）Black Gold染色：切片复水后放入60 ℃Black Gold Ⅱ染色液染色到合适深浅的颜色，染色时间15～20 min，采用95%、75%酒精进行梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

2 结果

2.1 两组小鼠神经功能评分比较

EAE组小鼠在首次免疫后第12天开始发病，在第19天症状最为显著，随后病情有所缓解，发病率为100%。EAE组小鼠首先出现尾部张力下降，接着出现尾部瘫痪拖垂、步态摇摆、后肢无力、后肢瘫痪等症状。对照组小鼠在首次免疫后第14天左右出现短暂的尾巴无力症状（图1）。

图1 两组小鼠神经功能评分比较

2.2 两组小鼠脱髓鞘情况比较

Black Gold髓鞘染色结果显示，EAE组小鼠脊髓白质着色比对照组浅，脊髓灰质的丝状着色明显减少（图2A～B），同时EAE组小鼠大脑胼胝体区域着色相比对照组更浅（图2C～D）。MBP的免疫荧光染色结果显示，EAE组小鼠脊髓和大脑的MBP着色较对照组浅（图3），提示EAE组小鼠脊髓和脑组织发生了脱髓鞘。

图2 两组小鼠脊髓组织Black Gold染色

图3 两组小鼠MBP免疫荧光染色

2.3 两组小鼠小胶质细胞增殖情况比较

免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，EAE组小鼠脊髓和大脑皮层区域的小胶质细胞数量明显增多，同时伴随小胶质细胞胞体增大、突起增多等形态学改变（图4），提示EAE组小鼠脊髓和脑组织的小胶质细胞处于增殖活化状态。

图4 两组小鼠Iba-1 染色

3 讨论

MS的病因和发病机制目前尚未明确，认可度较高的理论是由于病毒或某些抗原物质触发了机体自身免疫反应，从而损害髓鞘及其包裹的神经元轴突，基于该理论建立了不同的EAE模型，目前所制备的动物模型还不稳定，需要进一步探索。

本研究采用的抗原物质是MOG35-55多肽，与其他髓鞘蛋白相比，如MBP、髓鞘蛋白脂质蛋白（myelin proteolipid protein，PLP）等，MOG因在少突胶质细胞膜表面表达而具有很强的免疫原性，并且MBP的敏感小鼠品系是B10.PL和PL小鼠[6]，PLP的敏感小鼠品系是SJL和SWXJ小鼠[7-8]，这些品系在国内不易获得，而MOG的敏感小鼠品系C57BL/6J，是常见的实验小鼠品系。在构建EAE模型时，通常会加入强效佐剂CFA，增强抗原的免疫反应强度并延长免疫反应时间[9]，刺激大量吞噬细胞摄取和呈递抗原以及CD4+T细胞的增殖活化[10]，提高模型成功率。而PTX具有破坏血脑屏障的作用，使外周反应性T细胞得以进入中枢神经系统分泌相关细胞因子，促进炎症反应发生[10-11]。目前大多数EAE模型构建只进行1 次免疫诱导，本研究采用MOG35-55和CFA的混合乳剂两次加强诱导C57BL/6J小鼠，并对注射部位进行了调整，在小鼠双侧腹股沟和下肢分4 点进行皮下注射，于首次免疫后0、48 h腹腔注射PTX破坏血脑屏障，然后根据小鼠的行为学表现进行神经功能评分，并进行组织病理学检测，发现EAE组小鼠在免疫后第12 天开始发病，第19 天症状最为严重（神经功能评分＜3.5 分），表明该方法构建的EAE模型稳定，且发病率为100%。本研究中对照组小鼠在免疫后第14 天左右出现短暂的尾巴无力症状，推测是由CFA中的结核分枝杆菌及注射的PTX引发的炎症所造成的。脱髓鞘是MS主要的病理特征。本研究中Black Gold髓鞘染色和MBP免疫荧光染色结果表明，EAE组小鼠的脊髓和大脑胼胝体均出现脱髓鞘，并且大脑胼胝体的脱髓鞘要迟于脊髓，原因可能与免疫部位位于腹股沟和后肢有关。胶质细胞活化是MS常见的一个病理学特征，与中枢神经系统炎性损伤密切相关[12]。本研究发现，EAE组小鼠脊髓和大脑的小胶质细胞增殖活化，提示小胶质细胞参与了脱髓鞘和神经变性。活化的小胶质细胞在EAE发病过程中扮演着双重角色：一方面，小胶质细胞活化会增强抗MOG的自身免疫反应，参与炎症级联反应，加重髓鞘脱失和轴突损伤；另一方面，小胶质细胞能吞噬、清除崩解的髓鞘碎片，并招募少突胶质细胞前体细胞到达脱髓鞘部位进行髓鞘修复，促进髓鞘再生[13-14]。

综上所述，本研究建立的EAE模型发病率为100%，EAE组小鼠表现为平衡失调及运动功能障碍，脊髓和脑组织均发生髓鞘脱失及小胶质细胞活化，符合MS的临床表现及病理特征，因此本研究采用MOG35-55两次免疫C57BL/6J小鼠成功构建了EAE模型。该方法的优点在于易于诱导，能模拟出MS的典型特征（脱髓鞘和炎症损伤），且发病率高、病程稳定，但该模型也存在一定的局限性。EAE模型是人工诱导的免疫应答，以CD4+T细胞反应为主，而MS患者发生的免疫反应以CD8+T细胞和B细胞介导为主。此外，EAE诱导的脱髓鞘主要是轴突损伤后的继发性脱髓鞘，原发性脱髓鞘较少，故该模型与人类MS存在一定差异，仍需进行大量研究以建立更好的MS模型，为后续药物开发奠定基础。