利用CRISPR/Cas9 技术定向编辑加工番茄 SlACS2

刘江娜,张西英,白云凤,张爱萍

(新疆生产建设兵团 第六师农业科学研究所,新疆五家渠 832100)

番茄(Solanumlycopersicum)属于呼吸跃变型果实,在成熟过程中乙烯产量骤增,果实容易成熟过度而变软,致使耐压性能变差、贮藏期缩短、抗病原菌能力降低,严重影响到生产、贮运及加工品质。因此,探索能够抑制加工番茄果实过度软化、提高耐贮性、便利储存运输的方法显得尤为重要[1-3]。 利用基因工程手段调节番茄过熟软化、改善耐贮性取得一定进展, 途径主要有两条:(1)通过抑制乙烯合成,来提高果实耐受“成熟过渡” 的能力。乙烯的生物合成遵循甲硫氨酸 (Methionine,Met)→S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl methionine,SAM)→1- 氨基环丙烷 1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)→乙烯的途径。将 ACC 合酶(ACC synthase,ACS)[4-5]和ACC氧化酶(ACC oxidase,ACO)/乙烯形成酶(ethylene-forming enzyme,EFE) 反义基因[6-7]或 RNAi 基因[8-9]导入番茄,均可抑制乙烯合成,并已培育出耐贮运基因工程新品种‘华番 1 号’[10]。(2)抑制细胞壁果胶的降解。多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG) 是一种细胞壁蛋白,能将果实中果胶的 主要成分多聚半乳糖醛酸降解为半乳糖醛酸,使细胞结构解体,导致果实软化。把 PG 反义基因导入番茄,能抑制 PG 表达,提高番茄硬度,延缓过熟软化[11]。但因其是在植物原有基因组上整合了新序列,易引起民众的安全性 疑虑,增加转基因作物评价和应用成本。

近年来,以多种新型高效的DNA靶向内切酶为基础建立的基因组编辑技术,是对植物自身的基因进行定点修饰,提高了育种效率,规避了常规转基因可能产生的不良效应。基因编辑可分为锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(trans cription activator-like effector nuclease,TALEN)和CRISPR/Cas(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas))技术。ZFN和 TALEN是利用蛋白质识别特定的基因组靶位点,针对每一个突变位点需要构建两个相应的核酸酶,操作繁琐; CRISPR/Cas是利用更简单的核苷酸互补配对方式识别特定的基因组靶位点,比ZFN和TALEN编辑效率高,构建更简单。CRISPR/Cas9 系统的首篇报道发表于《科学》杂志上,研究发现 CRISPR/Cas9 系统可以在体外切割双链 DNA,实现了在活细胞中进行基因编辑[12]。随后因其操作较为简单、效率高、应用更为广泛,相继在甜橙[13-15]、葡萄[16-18]、猕猴桃[19]、芥蓝[20]、甘蓝[21]等园艺作物中成功实现了基因编辑。目前,学者利用CRISPR/Cas9技术已对番茄的多个基因,如转录因子RIN[22]、RNA编辑因子SlORRM4[23]、果实软化相关基因α-Man[24]及生长相关的DELLA基因[25]进行了编辑,也为提高番茄耐贮性提供了新思路[26]。

ACS是乙烯合成的限速酶。番茄是呼吸跃变型果实,其ACS(SlACS)由多基因家族编码,SlACS1A和SlACS6主导系统Ⅰ乙烯的合成,负责番茄果实在呼吸跃变前产生基础水平的少量乙烯,SlACS2和SlACS4主导系统Ⅱ乙烯的合成,在果实成熟过程中伴随呼吸跃变产生大量乙烯,催熟果实。系统Ⅱ乙烯具有自催化机制,使得番茄成熟过程难以控制,造成果实过熟软化、腐烂变质。番茄1-氨基环丙烷1-羧酸ACC(1-aminocyc lopropane- 1-carboxylic acid)是合成乙烯的直接前体,由ACC合酶(ACC synthase)SlACS催化生成。番茄SlACS2催化系统Ⅱ乙烯合成前体ACC的生成,是系统Ⅱ乙烯合成的重要限速酶。

利用CRISPR/Cas9技术敲除SlACS2基因,通过农杆菌介导的遗传转化获得ACS2突变体,不仅有利于研究SlACS2基因对番茄果实成熟及贮藏性能等方面的影响,进而培育耐贮藏品种,也为改良番茄的其他性状建立新途径,具有重要的生物学意义及商业价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料、载体及菌株

1.1.1 植物材料、菌株及试剂 试验所用材料为第六师农业科学研究所自育加工番茄(Solanumlycopersicum)品种‘新番72号’(650444),以期子叶为外植体,利用农杆菌介导的遗传转化方法进行转化。

大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α 与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所农业农村部园艺作物生物学与种质创制重点实验室保存,中间载体SIU6b::sgRNA购自GenScript 公司、PCAMBIA2300,PCB-DT1TA-SIU6P载体、表达载体sgRNA骨架载体pCAMBIA2300_SlU6p_sgRNA(CP185)和CRISPR/Cas9双元载体(CP178)由中国农科院蔬菜花卉研究所崔霞研究员惠赠。

1.1.2 试剂 限制性内切酶Eco31Ⅰ、AscⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ和 T4连接酶购于 NEB (New England Biolabs) 公司; KOD Fx DNA 聚合酶购于 Toyobo,日本; 凝胶回收和质粒提取试剂盒、DNA Marker、逆转录试剂盒等均购于宝生物工程(大连) 有限公司(TaKaRa) ; PCR 引物(表 1) 、序列测定等由华大基因完成。

1.2 方 法

1.2.1 特异性靶向SlACS2基因的sgRNA设计与合成 番茄SlACS2基因的克隆:根据NCBI已报道的SlACS2序列(GenBank ACCESSION:NM_001247249.2),利用Primer5.0 设计合成特异性引物SlACS2-F/SlACS2-R(表1),采用天根植物总RNA提取试剂盒提取番茄总RNA,利用非变性的1.2%琼脂糖凝胶,电泳检测所提RNA质量,以‘新番72’号总RNA为模板,采用宝生物PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒反转录合成cDNA第一链,以合成的cDNA链为模板对SlACS2基因进行扩增,扩增产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测,对获得的目的条带,用PCR产物纯化试剂盒进行回收,并送公司测序。对测序结果进行分析,明确其序列。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

靶向番茄SlACS2基因的sgRNA的设计:SlACS2-sgRNA的设计,具体步骤为: 打开靶点预测网站(https:/ /crispr．dbcls．jp/),利用靶位点在线设计工具“CRISPRdirect”,在文本框中输入基因序列,选择番茄物种,即可得出该基因序列所有的靶位点,综合考虑各项参数后选取几组靶位点。 长19nt的寡核苷酸sgRNA核心序列按GG(N)19NGG序列进行设计。

构建sgRNA的寡聚核苷酸: 根据选择的sgRNA核心序列,设计正义链引物和反义链引物,两条引物的5′端添加含有核酸内切酶AarⅠ识别位点的序列ATATCACCTGCACACTTTGG,以与载体质粒的黏性末端互补。正义链引物在添加序列的3′端为编辑位点197～215的序列GGATTAAGAGAAACCCAAA,编辑位点的3′端添加GTTTCAGAGCTATGCTGGAA (SEQ ID NO:5);反义链引物在添加序列的3′端为编辑位点276～254的反向互补序列TTGCCAAC- TTTCAAGATTA,编辑位点的3′端添加CCAAACTACACTGTTAGATTC(SEQ ID NO:6)。

1.2.2 植物表达载体的构建 以CP185为模板,用正义链引物(SEQ ID NO:5)和反义链引物(SEQ ID NO:6)进行PCR扩增,得到含有双sgRNA的DNA片段并连接至pEasy-blunt,测序无误后,用AarI酶切连接至CP178载体上,形成植物表达载体pSlACS2-DsgRNA(图1)。植物表达载体上的Cas9基因受35S驱动,两条sgRNA基因均受番茄U6启动子驱动。构建好的植物表达载体通过热激法转化到大肠杆菌DH5 菌株中扩增,通过测序验证载体序列正确,再通过冻融法转化农杆菌LBA4404菌株,以备侵染利用。

图1 植物表达载体pSlACS2-DsgRNA的构建Fig.1 Construction of plant expression vector pSlACS2-DSGRNA

1.2.3 农杆菌介导的加工番茄‘新番72号’遗传转化及抗性植株的获得 称取0.6 g籽粒饱满的‘新番72号’种子,在超净工作台内用75%的酒精处理30 s,无菌水冲洗2遍,倒掉无菌水再加入10%的漂白水,放置在摇床上晃动1 h左右,至种子泛白,取出种子用无菌水冲洗5遍,放置 在 4 ℃冰箱中冷藏12 h,取出处理好的种子(尽量控干多余水分)接种至1/2MS培养基中(不含蔗糖),每瓶接种50～60粒种子,培养温度为25～28 ℃、光照度1 800 lx、光照时间16 h,培养6 d获得无菌苗,剪取6 d苗龄的加工番茄无菌苗子叶为外置体在预培养基A1中预培养1 d(黑暗条件)。

取-80 ℃条件下保存的含有pSlACS2-DsgRNA质粒的农杆菌甘油菌,在固体YEB培养基平板上划线(Rif 50 mg/L 与Kan 50 mg/L),倒置于28 ℃条件下培养48 h,挑取含目的片段的农杆菌单菌落,接种于5 mL 的YEB 液体培养基中(含有50 mg/mL Kan和100 mg/mL Rif),置于摇床内200 r/min培养至OD≈1.0,取1 mL转入相同YEB培养基50 mL,培养至OD600=0.7,将预培养后的外植体在农杆菌悬浮液中轻微震荡15 min,之后,用滤纸吸干多余菌液,28 ℃共培养2 d(黑暗条件),转入抗性培养基A2(MS+玉米素(2 mg/L)+吲哚乙酸(1 mg/L)+卡那霉素(100 mg/L)+特美汀(300 mg/L)进行抗性筛选培养,每隔10～15 d将外植体转移至新的筛选培养基进行筛选培养,将获得的抗性不定芽转移至不定芽伸长培养基A3继续培养15～20 d,转入生根培养基A4中进行生根培养至成株。

培养基具体配方如下:A1预培养培养基的配方为MS+玉米素(1 mg/L)+吲哚乙酸 (1 mg/L)。A2分化培养基的配方为MS+玉米素(2 mg/L)+吲哚乙酸(1 mg/L)+卡那霉素(100 mg/L)+特美汀(300 mg/L)。A3不定芽伸长培养基配方MS+玉米素(2 mg/L)+吲哚乙酸(1 mg/L)+卡那霉素(50 mg/L)+特美汀(300 mg/L)。A4生根培养基的配方为MS+吲哚乙酸(1 mg/L)+卡那霉素(50 mg/L)+特美汀(300 mg/L)。

1.2.4 转基因植株的分子检测 以加工番茄‘新番72号’野生型和抗性再生植株幼嫩叶片为材料,使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取T0代植株叶片DNA,利用Cas9特异引物扩增载体特异片段,扩增出目的片段的即为转基因阳性植株。

2 结果与分析

2.1 SlACS2基因的克隆与植物表达载体的构建

以加工番茄‘新番72号’RNA为模板,以 SlACS2-F/SlACS2-R为引物,进行RT-PCR 扩增,对其扩增产物进行测序获得SlACS2的cDNA序列,大小为1 458 bp。将测序结果与网上公布的序列,通过DNAstar进行比对分析二者相似度达到100%,证明克隆的基因是所要获得的目标基因。对其gDNA比对结果发现,SlACS2由3个内含子和4个外显子组成,根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,利用CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp/),在SlACS2第2外显子上筛选到2个靶位点(图2-A),sgRNA靶位点序列1和2在番茄基因组1号染色体,之后设计一对包含 2 个 Target 和 Aar I 酶切位点的引物(SEQ ID NO:5+ SEQ ID NO:6),以 CP185载体为模板,扩增 sg RNA1_U6-26t_Sl U6p_sg RNA2 片段并连接至pEasy-blunt,测序无误后,然后用 Aar I (Thermo, ER1581)酶切sg RNA1_U6-26t_Sl U6p_sg RNA2 片段和终载体CP178。最后用T4DNA 连接酶(NEB,M0202)进行连接, 将连接成功的sg RNA1_U6-26t_Sl U6p_sg RNA2 表达盒组装到CP178载体上,构建成终载体pSlACS2-DsgRNA(图2-B)。菌液 PCR 和测序获得正确载体,并用于加工番茄的遗传转化。表1为构建 CRISPR/Cas9 载体所用的引物。

A.双gRNA靶位点在 SlACS2中的位置;B.pSlACS2-DsgRNA-T1质粒T-DNA区示意图

2.2 农杆菌介导的加工番茄‘新番72号’子叶遗传转化

以加工番茄子叶为外植体,经过种子萌发后(图3-A),取无菌培养的番茄子叶剪切后于预培养培养基上预培养1 d(黑暗条件),再置于含基因编辑表达载体 pSlACS2-DsgRNA的农杆菌28 ℃共培养2 d(黑暗条件)(图3-B),转入抗性培养基进行抗性筛选培养,获得抗性愈伤组织(图3-C),培养20～45 d诱导出抗性不定芽(图3-D),再在芽伸长培养基中筛选培养15 d(图3-E),最终转入生根培养基中进行生根培养,获得卡那抗性的再生植株。

2.3 T0代阳性植株分子鉴定

对获得的31株抗性再生植株编号,每株取 0.2 g嫩叶提取基因组总DNA后,利用特异引物Cas9-F和Cas9-R进行PCR 扩增,以植物编辑表达载体质粒为阳性对照,结果表明,其中22株扩增出了大小为841 bp(与阳性对照一致)的条带,野生株未扩增出目的条带(图4),初步表明已将Cas9基因转化到受体细胞中。

M.DL2000 maker;WT.野生型;P.阳性质粒;1～31.抗性植株编号

2.4 SlACS2突变体植株的基因突变类型鉴定

为进一步获得纯合突变植株,提取T1代植株的叶片DNA,以(xp3196+xp3199)作为靶位点上下游特异引物进行PCR 扩增,然后将对应的PCR产物回收转化大肠杆菌DH5 ,进行测序。使用 DNAMAN 对测序结果进行比对分析,结果发现共有6种突变类型,主要以碱基的缺失和插入为主,未发现有碱基替换,除GE1和GE3仅在一处靶位点发生碱基的缺失外,其余均同时在2个编辑位点发生碱基的缺失或插入,具体编辑类型如图5-A所示,其中GE1由于在靶位点2处缺失7个核苷酸,造成其在第113位和114位氨基酸发生缺失,同时自第116位氨基酸后发生移码(如图5-B);GE2因在在靶位点1处缺失1个核苷酸致使自第98至112位氨基酸发生移码,同时靶位点2处缺失7个核苷酸,造成其在第113位和114位氨基酸发生缺失,同时自第116位氨基酸后发生移码;GE3在靶位点1处缺失4个碱基,致使GE4在靶位点1处缺失5个核苷酸同时靶位点2处缺失7个核苷酸,GE5在靶位点1处有1个单碱基的插入同时靶位点2处缺失7个核苷酸,GE6在靶位点1处缺失9个核苷酸同时靶位点2处缺失7个核苷酸。

A. SlACS2突变体与野生型核苷酸序列比对; B. SlACS2突变体与野生型氨基酸序列比对A.Comparison of SlACS2 mutants with wild-type nucleotide sequences;B.Comparison of SlACS2 mutants with wild-type amino acids图5 SlACS2突变体与野生型核苷酸及氨基酸序列比对分析Fig.5 Comparative analysis of nucleotide and amino acid sequences between SlACS2 mutant and wild-type

3 讨 论

ACS作为乙烯形成的关键酶[27],由多基因家族编码。通过抑制ACS的表达抑制乙烯的产生,从而调控果实成熟的研究方法,多集中于反义RNA的研究[28-29],其效果显著。将反义ACS基因转入番茄子叶,得到了乙烯合成受抑制的转基因番茄,在没有乙烯合成的情况下,番茄果实的成熟衰老受抑制,果实不变红,硬度较大,耐失水,在室温下可贮藏2～3个月[30];Oeller等[4]将ACS的基因ACS2反向插入载体并转化番茄后,大大降低了乙烯合成量,成功控制了果实的成熟;熊爱生等[31]将ACC氧化酶和ACC合成酶(ACS)反义 RNA融合基因导入番茄,经过4代选择获得了表现良好的转基因材料,乙烯释放量仅为野生型材料的9.5%, 达到阻遏番茄果实中乙烯的形成的目的,显著地提高番茄果实的耐贮存性能;生吉萍等[32]发现转翻译ACS的番茄果实在没有乙烯存在的情况下继续完成生长发育,并缓慢进入成熟衰老阶段;综上所述,虽然将外源基因导入番茄改善耐贮性取得了一定的进展,比常规育种缩短了育种周期,拓宽了基因来源,但由于番茄基因组上整合的是外源基因,易使民众产生安全性疑虑,影响了基因工程育种效率及推广应用。

CRISPR-Cas9 系统对目标基因进行精确的原位编辑后,不必再通过转基因调控目标基因功能。由于sgRNA-Cas9基因的整合位点和编辑位点是分离的,因此可通过遗传分离剔除sgRNA-Cas9基因,比常规转基因技术安全可靠;编辑修饰的基因只有少数核苷酸改变,与自然突变或人工理化诱变本质相同,而在效率和可控性方面则远远优于诱变育种。番茄基因组较小,基因组测序已经完成(Tomato Genome Consortium,2012),遗传转化体系也已成熟。迄今利用 CRISPR-Cas9 系统对番茄的ARGONAUTE7基因进行了编辑,获得了复叶畸形突变体[33],但鲜见改良番茄农艺性状的报道。番茄是二倍体自花授粉作物,利用 CRISPR-Cas9 系统原位定点修饰乙烯代谢相关基因以迟滞番茄过熟腐烂,并通过自交分离剔除sgRNA-Cas9基因,获得无转基因序列的耐贮运新品种,无疑对新疆番茄的生产加工业具有重要的应用价值,也将为利用 CRISPR-Cas9 系统改良番茄其他农艺性状、培育无转基因序列的新品种探索新途径。

利用 CRISPR/Cas9技术进行单个位点的编辑,如果编辑位点发生碱基替换,而替换的碱基仅仅造成同义突变,该编辑则是无效编辑;如果编辑位点发生了碱基插入或缺失,插入或缺失的碱基数为3的倍数,尽管会造成氨基酸数量的改变,但不一定会造成移码突变,编码的蛋白质仍然保持原有功能。为了增加基因编辑的有效性,本研究采用了双位点编辑策略,2个编辑位点的PAM之间相隔79 bp。在产生的突变体中,有单位点突变,也有双位点突变,包括双位点均发生碱基缺失,但两个位点间的序列没有完全删除。先前有文献报道,两个基因编辑位点之间相隔66 bp,得到了中间片段删除的突变类型[33]。大片段序列的删除,无疑会减少翻译失活蛋白的能量消耗。两个基因编辑位点之间的序列能否删除,除了与位点之间的距离相关外,是否还有其他影响因素,尚需进一步探讨。