颅内大动脉粥样硬化型急性脑梗死患者血清Annexin A2、miR-9-5p表达与颅内动脉粥样斑块负荷、病情严重程度的关系

李波,徐世成,赵安容,李垚,张磊

急性脑梗死(acute cerebral infarction,ACI)是一种发病率较高的脑血管疾病,具有较高的致残率和病死率,呈现年轻化趋势[1-2]。颅内大动脉粥样硬化型是其重要分型,其发病因素复杂,颅内动脉粥样硬化斑块破裂形成的血栓是其病因之一[3]。颅内动脉粥样斑块负荷会影响ACI患者病情严重程度,大部分ACI患者伴有颅内动脉粥样硬化,累及多个动脉节段[4-5]。故研究与ACI颅内动脉粥样斑块负荷、病情严重程度有关的血清标志物,对ACI防治、改善预后有重要临床价值。膜联蛋白A2(Annexin A2)是一种磷脂结合蛋白,可增强吞噬细胞的吞噬作用,诱导产生炎性细胞因子,促进动脉粥样硬化斑块形成,且与颈动脉斑块稳定性有关[6-7]。微小RNA(microRNA,miRNA)参与炎性反应、内皮细胞损伤、肿瘤、代谢性疾病、ACI等过程[8-9]。miR-9-5p作为一种miRNA分子能减轻脑缺血再灌注损伤并抑制炎性反应,在脑血管动脉急性梗死的发生发展中起保护作用,并且参与血管损伤修复、血管新生等过程[10]。因此,现分析血清Annexin A2、miR-9-5p表达与颅内大动脉粥样硬化型ACI患者颅内动脉粥样斑块负荷、病情严重程度的关系,旨在为临床该病诊治提供依据,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年1月—2022年10月四川省巴中市中心医院神经内科收治的颅内大动脉粥样硬化型ACI患者170例作为研究组,同期选取体检健康志愿者173例作为健康对照组。研究组男90例,女80例,年龄(60.84±9.68)岁;合并高血压20例,糖尿病52例;家族遗传史10例;发病至入院时间(36.82±9.04)h。健康对照组男97例,女76例,年龄(60.03±8.99)岁。2组性别、年龄、体质量指数(BMI)、饮酒史、吸烟史、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)比较差异无统计学意义(P>0.05);研究组三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平均明显高于健康对照组(P<0.05),见表1。本研究经医院伦理委员会审核批准(BYLS2018-11-3),受试者或家属均知情同意并签署知情同意书。

表1 健康对照组和研究组临床资料比较

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①患者均符合ACI相关诊断标准,且均属于颅内大动脉粥样硬化型[11];②首次发病;③住院期间未发生感染者;④临床检查证实有梗死病灶;⑤发病至入院时间小于72 h。(2)排除标准:①出血性脑梗死、小动脉闭塞、心源性栓塞等脑梗死;②合并自身免疫疾病、肿瘤及感染者;③有颈动脉或颅内手术史;④发病后已进行溶栓治疗;⑤颅内动脉瘤等其他病变;⑥精神疾病者。

1.3 观测指标与方法 患者于入院后次日清晨、体检健康者于体检时采集空腹肘静脉血8 ml,离心留取血清,-70℃贮存。

1.3.1 血清Annexin A2、miR-9-5p表达检测: 取冻存的血清样本,解冻后,采用酶联免疫吸附法检测血清Annexin A2水平,试剂盒购自天津康尔克生物科技有限公司(批号SYH-36071)。以RNA提取试剂盒(购自北京擎科生物科技有限公司,批号TOA307)获取血清中总RNA,反转录为cDNA,采用荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测血清miR-9-5p相对表达量(PCR试剂盒购自重庆致宏生物科技有限公司,批号19635M)。qRT-PCR反应条件为95℃,3 min;91℃ 30 s、60℃ 35 s、73℃ 29 s,共37个循环。miR-9-5p、内参U6由广州卢卡科技有限公司合成,引物序列见表2。采用2-△△CT法检测血清miR-9-5p水平。

表2 miR-9-5p引物序列

1.3.2 颅内动脉粥样斑块负荷测定:患者入院后24 h内,采用磁共振扫描仪(荷兰飞利浦公司,型号Achieva 3.0T)分析ACI患者颅内动脉粥样硬化斑块和管壁结构的成分,通过扫描患者大脑动脉3D-TOF序列获得血管完整的图像,然后进行高分辨率扫描垂直于血管狭窄的部位,然后将获得的血管完整影像和狭窄部位影像资料由专业影像科医生进行数据分析和定量测量,在高分辨率大脑动脉图像上测得血管总面积、最狭窄血管的管腔面积。颅内动脉粥样斑块负荷=(血管总面积-最狭窄血管的管腔面积)/血管总面积。

1.3.3 病情严重程度评估及分组:颅内大动脉粥样硬化型ACI患者入院后24 h内采用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分对患者进行病情严重程度评估,总分为42分,分值越大,表示神经功能缺损越严重(病情越严重)。根据NIHSS评分分值分为轻度ACI亚组39例(NIHSS<5分)、中度ACI亚组56例(5～15分)和重度ACI亚组75例(NIHSS>15分)[12]。

2 结 果

2.1 血清Annexin A2、miR-9-5p表达比较 与健康对照组比较,研究组血清Annexin A2水平明显升高(P<0.01),miR-9-5p表达明显降低(P<0.01),见表3。

表3 健康对照组和研究组血清Annexin A2、miR-9-5p表达比较

2.2 颅内动脉粥样斑块负荷、NIHSS评分情况 颅内大动脉粥样硬化型ACI患者颅内动脉粥样斑块负荷为(0.71±0.16),NIHSS评分为(16.40±4.81)分。

2.3 不同病情程度患者血清Annexin A2、miR-9-5p、颅内动脉粥样斑块负荷、NIHSS评分比较 轻度ACI亚组、中度ACI亚组、重度ACI亚组血清Annexin A2水平、颅内动脉粥样斑块负荷、NIHSS评分依次升高(P<0.01),miR-9-5p表达依次降低(P<0.01),见表4。

表4 3组ACI亚型患者血清Annexin A2、miR-9-5p、颅内动脉粥样斑块负荷、NIHSS评分比较

2.4 血清Annexin A2、miR-9-5p表达及其与颅内动脉粥样斑块负荷、NIHSS评分的相关性分析 Pearson法相关分析显示,颅内大动脉粥样硬化型ACI患者血清Annexin A2与miR-9-5p表达呈负相关(P<0.01);血清Annexin A2水平与颅内动脉粥样斑块负荷、NIHSS评分呈正相关(P<0.01),血清miR-9-5p表达与颅内动脉粥样斑块负荷、NIHSS评分呈负相关(P<0.01),见表5。

表5 血清Annexin A2、miR-9-5p表达及其与颅内动脉粥样斑块负荷、NIHSS评分的相关性分析

2.5 影响颅内大动脉粥样硬化型ACI发生的多因素Logistic回归分析 以发生颅内大动脉粥样硬化型ACI为因变量,以TG、TC、hs-CRP、Annexin A2、miR-9-5p、颅内动脉粥样斑块负荷为自变量纳入Logistic回归分析,结果显示,血清Annexin A2水平高、颅内动脉粥样斑块负荷高是ACI发生的危险因素(P<0.05),miR-9-5p表达高是其保护因素(P<0.05),见表6。

2.6 血清Annexin A2、miR-9-5p表达对重度颅内大动脉粥样硬化型ACI发生的预测价值 绘制血清Annexin A2、miR-9-5p表达对重度颅内大动脉粥样硬化型ACI发生的预测效能ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示,血清Annexin A2、miR-9-5p及二者联合预测重度颅内大动脉粥样硬化型ACI发生的AUC分别为0.833、0.791、0.925,二者联合的AUC优于血清Annexin A2、miR-9-5p单独预测的AUC(Z/P=2.530/0.011、3.364/0.001),见图1、表7。

图1 血清Annexin A2、miR-9-5p表达预测重度颅内大动脉粥样硬化型ACI发生的ROC曲线

表7 血清Annexin A2、miR-9-5p表达对重度颅内大动脉粥样硬化型ACI发生的预测价值

3 讨 论

ACI是由多种因素引发的脑血管疾病,随着高血压、冠心病、高血脂等发生率增加,ACI的发病率也呈逐年升高趋势[13]。颅内动脉粥样硬化是ACI形成的病因之一,颅内动脉粥样斑块负荷对判断ACI严重程度具有较高的价值,并且颅内动脉粥样硬化严重程度又与患者神经功能恢复有关[14-15]。因此,研究ACI患者颅内动脉粥样斑块负荷、病情严重程度有关的血清标志物对ACI的防治和改善ACI患者的生活质量具有非常重要的意义。

Annexin又称为钙磷脂结合蛋白,其可参与细胞信号传导、形成生物膜、调控细胞生物学活动等[16]。Annexin A2以四聚体的结构形式存在,分子量约为36 000,是一种新型的炎性标志物,存在于中性粒细胞、内皮细胞等细胞中,其中约有1/3的Annexin A2是由血管内皮细胞生成的,具有促进炎性反应的作用[17]。近期有研究显示,Annexin A2在不稳定性斑块患者中表达水平高于稳定性斑块,是急性缺血性脑卒中患者颈动脉斑块稳定性的影响因素[6]。本研究发现,颅内大动脉粥样硬化型ACI患者血清Annexin A2水平升高,说明Annexin A2参与ACI病理过程。血清Annexin A2水平随ACI病情严重程度加重而升高,提示血清Annexin A2可能参与ACI的发生发展过程。已有研究证实,Annexin A2在冠心病患者血清中呈高表达,Annexin A2可调控血脂的转运及血管内皮生长因子,在粥样硬化性脑血管损伤中具有重要作用[18]。根据以往研究推测Annexin A2可能通过促进炎性反应加速内皮细胞损伤参与疾病的发生,加重中性粒细胞及吞噬细胞对脑组织损伤的干预作用。NIHSS评分越高,ACI患者病情越严重,颅内动脉粥样斑块负荷越高,说明ACI患者颅内供血严重不足[19-20]。经Pearson法分析颅内大动脉粥样硬化型ACI患者血清Annexin A2水平与颅内动脉粥样斑块负荷、NIHSS评分呈正相关,提示Annexin A2与ACI颅内动脉粥样斑块负荷及病情严重程度有关,说明Annexin A2可在一定程度上反映ACI病情,从而利于辅助临床治疗。

miRNA是一种内源性非编码小分子RNA,广泛存在于真核生物中,已有研究证实miRNA参与ACI发生发展[21-22]。miR-9-5p作为一种miRNA分子,广泛参与多囊卵巢综合征、大脑中动脉闭塞等多种疾病的发生[23-24]。Wang等[25]研究表明,miR-9a-5p在大脑中动脉闭塞大鼠模型中表达下调,miR-9a-5p可能会减轻大脑中动脉闭塞诱导的缺血损伤。本研究发现,颅内大动脉粥样硬化型ACI患者血清miR-9-5p表达明显降低,且miR-9-5p表达随ACI病情严重程度的加重而降低,提示miR-9-5p在ACI发生发展过程中起重要作用,推测miR-9-5p可能通过减少内皮细胞损伤,促进血管生成抑制疾病的发生。过表达miR-9-5p通过靶向ERMP1,介导内质网应激来提高细胞活力并抑制神经元凋亡,减轻缺血性卒中,且大脑中miR-9-5p表达有助于神经修复[26]。Pearson相关性分析结果显示,颅内大动脉粥样硬化型ACI患者血清miR-9-5p表达与颅内动脉粥样斑块负荷、NIHSS评分呈负相关,提示miR-9-5p与ACI患者病情严重程度及颅内动脉粥样斑块负荷有关,miR-9-5p可调控血管内皮因子,维护血管完整性,促进新生血管形成,在颅内动脉粥样硬化ACI中发挥积极作用。本研究还发现,颅内大动脉粥样硬化型ACI患者血清Annexin A2与miR-9-5p表达呈负相关,说明Annexin A2与miR-9-5p可能在ACI中存在调控作用,但具体机制仍需要后续探究。Logistic回归分析显示,血清Annexin A2水平高、miR-9-5p水平低、颅内动脉粥样斑块负荷高是ACI发生的危险因素,说明Annexin A2水平升高,miR-9-5p表达降低,介导血管平滑肌细胞增殖、迁移,损害内皮细胞,造成动脉硬化,促进ACI发生,及时监测血清Annexin A2、miR-9-5p等指标水平变化,对临床预防ACI发生甚是有益。同时,颅内动脉粥样斑块负荷较高者临床应建立高危预警体系,给予重点关注,以降低ACI风险。本研究ROC曲线结果显示,血清Annexin A2联合miR-9-5p表达预测重度颅内大动脉粥样硬化型ACI的AUC为0.925,优于单一指标预测效能,说明监测血清Annexin A2、miR-9-5p表达变化能够为重度颅内大动脉粥样硬化型ACI发生提供参考。

综上所述,颅内大动脉粥样硬化型ACI患者血清Annexin A2水平升高,miR-9-5p表达降低,二者呈负相关,且均与颅内动脉粥样斑块负荷、病情严重程度有关,能够为临床病情预测、病理机制解析提供参考。本研究不足之处:引起ACI发生的可能影响因素纳入不足,导致结果存在偏倚;样本量小,未探究血清Annexin A2、miR-9-5p表达与ACI患者预后的关系;尚未明确血清Annexin A2、miR-9-5p表达与颅内动脉粥样斑块负荷、病情严重程度的具体调控机制,仍需要基础实验探究血清Annexin A2、miR-9-5p表达异常的机制和作用,随后扩大样本,追踪随访,展开深入研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

李波:设计研究方案,课题设计,实施研究过程,论文撰写;徐世成:提出研究思路,分析试验数据,论文审核;赵安容:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;李垚、张磊:进行统计学分析