天钩平肝颗粒质量标准研究*

徐 伟，周 茜，王靖雯，范润勇，蒲立立，张 明，杨云芝△

（1. 四川省南充市中医医院，四川南充 637000； 2. 四川省南充市食品药品检验所，四川南充 637000）

天钩平肝汤（煎剂）为四川省名老中医徐仕宏的经验方，由《杂病证治新义》中的天麻钩藤饮和《金匮要略》中的泽泻汤加减而成，具有平抑肝阳及渗湿利尿功效，临床用于治疗肝阳上亢型高血压所引起的头痛、眩晕、耳鸣、眼花、震颤、失眠等症状。天麻钩藤饮和泽泻汤均可降低肝阳上亢型自发性高血压模型大鼠的血压［1］，以及改善高血压模型小鼠的氧化应激和炎症［2-3］；泽泻汤还可通过相关信号通路降低盐敏感性高血压模型大鼠的血压［4-6］。由于煎剂存在煎煮烦琐、携带与储存不便、患者依从性差等问题，故在不改变原有物质基础的前提下，我院拟将天钩平肝汤开发为颗粒剂。本研究中拟采用薄层色谱（TLC）法对制剂组方药材中的川芎、首乌藤和葛根进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法对煎剂、颗粒及其药材样品中的天麻素、栀子苷、葛根素、黄芩苷进行含量测定，以为制订天钩平肝颗粒的质量标准提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ultimate 3000 型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；AUW220D 型分析天平（日本Shimadzu 公司）；FA2004 型分析天平（上海力辰科技仪器有限公司）；TD5A型医用离心机（常州市金坛高科仪器厂）；G-100S型超声波清洗器（深圳市歌能清洗设备有限公司）；ZF - 2 型三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂）；RE - 1102 型旋转蒸发仪（上海嘉鹏科技有限公司）；SYG-4 型数显恒温水浴锅（常州朗越仪器制造有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵（上海力辰科技仪器有限公司）；WGL-45B型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；LCK2000 型煎药机（天津三延精密机械有限公司）。

1.2 试药

天钩平肝汤（医院中药房自制，编号分别为J220501，J220502，J220503；均含天麻10 g、炒栀子15 g、葛根30 g、酒黄芩15 g 等，每份500 mL）；天钩平肝颗粒（医院中药制剂中心，批号分别为220501，220502，220503，规格为每袋15 g）；天麻素对照品（批号为110807-202010，含量95.5%），栀子苷对照品（批号为110749-201919，含量97.1%），葛根素对照品（批号为110752-201816，含量95.4%），黄芩苷对照品（批号为110715-202122，含量94.2%），大黄素对照品（批号为110756-201913，含量96.0%），川芎对照药材（批号为120918 - 201813），均购自中国食品药品检定研究院；硅胶G 薄层板、硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工有限公司）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为怡宝纯净水；天麻（批号分别为200501，200601，200701），炒栀子（批号分别为200401，200501，200701），葛根（批号分别为201201，210301，210401），酒黄芩（批号分别为200501，200601，200701），首乌藤（批号分别为200401，200501，200601），川芎（批号分别为210601，210701，210901），其他原料药材，均购自成都吉安康药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

川芎：取煎剂样品25 mL，加乙酸乙酯萃取3 次，每次20 mL，合并有机相，水浴蒸干，加2 mL甲醇溶解固形物，即得供试品溶液Ⅰ。取颗粒样品10 g，加乙酸乙酯60 mL，超声（功率250 W、频率40 kHz，下同）提取30 min，滤过，滤液水浴蒸干，加2 mL 甲醇溶解固形物，即得供试品溶液Ⅱ。取川芎对照药材粉末0.5 g，精密称定，加乙酸乙酯30 mL，超声提取40 min，滤过，滤液水浴蒸干，固形物加2 mL 甲醇溶解，即得对照药材溶液。按天钩平肝颗粒处方和工艺制备缺川芎的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020年版《中国药典（一部）》TLC 法［7］42，吸取上述溶液各5～10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（5∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 A。

图1 薄层色谱图1，1'.Negative reference solution 2，2'.Reference medicinal material solution or reference solution 3-5.Test solution Ⅰ（numbers：J220501，J220502，J220503） 6-8.Test solution Ⅱ（batch numbers：220501，220502，220503）A.Chuanxiong Rhizoma B.Polygoni Multiflori Caulis C.Puerariae Lobatae RadixFig.1 TLC chromatograms

首乌藤：取大黄素对照品适量，加甲醇制成质量浓度为0.5 mg/mL 的对照品溶液。按川芎鉴别项下方法制备缺首乌藤的阴性样品，并制备阴性对照品溶液。按2020年版《中国药典（一部）》TLC法［7］277，吸取上述溶液及川芎鉴别项下供试品溶液各5～10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶1∶0.1，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 B。

葛根：取葛根素对照品适量，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL 的对照品溶液。按川芎鉴别项下方法制备缺葛根的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典》（一部）TLC法［7］347，吸取上述溶液及川芎鉴别项下供试品溶液各5～10 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸（4∶1∶0.2，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 C。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

天麻素：色谱柱为Agilent Zorbax SB - Phenyl 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（6∶94，V/V）；流速为1.0 mL/ min；检测波长为220 nm；柱温为25 ℃；进样量为10 μL。

栀子苷、葛根素、黄芩苷：色谱柱同上；流动相为乙腈（A）- 0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～18 min 时12%A，18～30 min 时12%A→27%A，30～45 min 时27%A）；检测波长为238 nm；柱温为25 ℃；进样量为2 μL。

2.2.2 溶液制备

对照品溶液：分别取天麻素对照品10.62 mg 和栀子苷对照品8.90 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为101.42，86.42 μg/ mL 的单一对照品溶液；分别取葛根素对照品15.50 mg 和黄芩苷对照品13.27 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加50%甲醇溶解（配置葛根素溶液需先加热至65 ℃，溶解后冷却至室温），定容，制成质量浓度分别为591.48，500.01 μg/ mL 的单一对照品溶液。分别精密吸取栀子苷、葛根素、黄芩苷对照品溶液8.68，3.00，10.00 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成质量浓度分别为15.00，35.49，100.00 μg/ mL 的混合对照品溶液。

供试品溶液：取煎剂样品5 mL，加水定容至25 mL，吸取5 mL，再加水定容至25 mL，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液Ⅲ；取颗粒样品2 g，精密称定，加水定容至25 mL，超声提取40 min，4 000 r/min离心15 min，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液Ⅳ。

阴性对照品溶液：按天钩平肝颗粒处方和工艺制备缺天麻、炒栀子、葛根、酒黄芩的单一阴性样品，按供试品溶液制备方法制得单一阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2.2 项下对照品溶液、供试品溶液Ⅳ、阴性对照品溶液各适量，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果阴性对照品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处无干扰峰，表明专属性良好。详见图2、图3。

图2 天麻素的高效液相色谱图1.Gastrodin A.Reference solution B.Test solution Ⅳ C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms of gastrodin

图3 栀子苷、葛根素、黄芩苷的高效液相色谱图1.Geniposide 2.Puerarin 3.Baicalin A.Mixed reference solution B.Test solution Ⅳ C.Negative reference solution lacking stir - fried Gardeniae Fructus D.Negative referencesolution lacking Puerariae Lobatae Radix E.Negative reference solution lacking wine - processed Scutellariae RadixFig.3 HPLC chromatograms of geniposide，puerarin and baicalin

线性关系考察：分别精密量取2.2.2项下天麻素对照品溶液0.125，0.25，0.5，1，2，4，6 μL，混合对照品溶液0.5，1，2，4，6，8，10，12 μL，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（X，ng）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程及线性范围。详见表1。

表1 线性关系考察结果Tab.1 Results of the linear relation test

精密度试验：取2.2.2项下天麻素对照品溶液及混合对照品溶液各适量，按2.2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果天麻素、栀子苷、葛根素、黄芩苷峰面积的RSD分别为0.95%，0.17%，0.15%，1.33%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，6，12，24 h时按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果天麻素、栀子苷、葛根素、黄芩苷峰面积的RSD分别为2.53%，1.85%，0.32%，1.97%（n=6），表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：精密称取样品适量，各6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果天麻素、栀子苷、葛根素、黄芩苷含量的RSD分别为1.77%，0.69%，0.45%，2.32%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品适量，共6份，分别加入一定质量浓度的单一对照品溶液，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 样品含量测定

取煎剂及颗粒样品各适量，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定，平行3次，记录峰面积，并计算样品含量，结果见表3。

表3 煎剂、颗粒待测成分含量测定结果（mg/mL，n=3）Tab.3 Results of the content determination of components to be determined in decoction and granules（mg/mL，n=3）

2.2.5 待测成分转移率

按药典方法提取天麻、炒栀子、葛根、酒黄芩药材样品中的活性成分，并按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，计算天麻素、栀子苷、葛根素、黄芩苷的含量；按各批次煎剂和颗粒对应的每克生药提取量计算各活性成分的转移率。结果见表4。

表4 目标成分转移率测定结果（n=3）Tab.4 Results of transfer rate determination of target components（n=3）

3 讨论

天钩平肝汤由天麻、钩藤、石决明、炒栀子、酒黄芩、葛根、川芎、首乌藤、白术、泽泻、罗布麻叶、炒酸枣仁等组方，预试验中对颗粒样品中的天麻、钩藤、酸枣仁、白术、川芎、首乌藤、葛根、红花进行TLC［7］鉴别。其中，钩藤中的异钩藤碱及白术中的苍术酮未检出；天麻中的天麻素，酸枣仁中的酸枣仁皂苷A 和酸枣仁皂苷B，红花中的羟基红花黄色素A因分离效果差，杂质干扰严重，显色不明显，故均未纳入。川芎、首乌藤、葛根的TLC鉴别结果显示，其斑点显色清晰，分离度较好，可进行优化研究。故在药典方法基础上改进为本研究中的条件，结果目标斑点成点性好，显色清晰、明亮、易观察，阴性对照无干扰。

天钩平肝颗粒组方中的天麻可抑制血压升高［8］，活性成分天麻素的注射液联合常规治疗可降低患者的收缩压和舒张压［9］；栀子提取物可降压［10-11］；葛根总黄酮可显著降低血压和降低脑血管阻力［12］，葛根素可降低模型大鼠的收缩压和舒张压［13］；黄芩苷可扩张血管［14-15］。故本研究中选用天麻素、栀子苷、葛根素、黄芩苷作为含量测定指标。预试验中考察了栀子苷（238 nm）、葛根素（250 nm）、黄芩苷（280 nm）在其最大吸收波长处的其他目标峰峰面积，当波长为238 nm 时，杂质峰干扰小，各目标峰峰面积较理想；考察了不同类型色谱柱（Agilent Zorbax SB-C18柱、Agilent Eclipse XDB-C18柱、Agilent Zorbax SB - Phenyl 柱），不同溶剂系统（甲醇-水、甲醇- 0.1%磷酸溶液、乙腈- 0.1%磷酸溶液）对天麻素、栀子苷、葛根素、黄芩苷与杂质色谱峰分离效果的影响，结果在本研究中色谱条件下供试品溶液色谱峰峰形较好，峰宽小，分离度大于1.5，理论板数大于5 000，拖尾因子为0.95～1.10。

本研究中对天钩平肝煎剂、颗粒及其所用原料中天麻素、栀子苷、葛根素和黄芩苷的含量进行测定，确定煎剂与颗粒中各活性成分的含量和转移率。结果证实，天钩平肝颗粒转移率明显优于其煎剂。根据颗粒样品中每袋所含药材的生药量，对天钩平肝颗粒中待测成分含量进行限定，每袋含天麻素、栀子苷、葛根素、黄芩苷分别不得低于1.1，19.7，56.9，102.2 mg。

综上所述，本研究中建立了天钩平肝煎剂和颗粒中川芎、首乌藤、葛根的定性鉴别方法及主要功效成分的含量测定方法，精密度高，重复性好，稳定可靠；同时，依据转移率和原料药材活性成分限量对天钩平肝颗粒各活性成分含量进行了限定，可为其质量标准的建立提供参考。