正交试验优选吴茱萸汤提取工艺*

安中原，陈育煌，余 巧，申 茹，毛一中

（惠州卫生职业技术学院·广东省惠州市药用植物研究与开发重点实验室，广东惠州 516025）

吴茱萸汤出自东汉张仲景的《伤寒论》，由吴茱萸、生姜、人参和大枣组方，具有暖肝温胃、降逆止呕功效［1］。该方可改善机体脾胃虚寒或肝经寒气上逆，具有止呕、抗消化道溃疡、镇痛、镇静等作用［2-5］，临床广泛用于胃炎、胃痛、胃食管反流、呕吐等消化系统疾病的治疗［6-9］。将吴茱萸汤开发成胃内漂浮片，可避免煎剂使用不便、不易携带和储存等缺点，还能延长药物在胃内停留和释放的时间，提高其生物利用度。吴茱萸碱和吴茱萸次碱是吴茱萸汤的活性成分［10］，可作为其质量控制指标。为使处方药材中活性成分提取最大化，本研究中采用正交试验法，以乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数为考察因素，以吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量的综合得分为评价指标，优化吴茱萸汤的提取工艺，为其胃内漂浮片的制备提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；FA2004N 型电子天平（上海菁海仪器有限公司，精度为0.1 mg）；JA3003 型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司，精度为1 mg）；KQ - 500VSM 型双频静音型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；B -220 型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；Direct -PureRO 10型纯水仪（上海乐枫生物科技有限公司）。

1.2 试药

吴茱萸碱对照品（批号分别为BWB50890和210818）、吴茱萸次碱对照品（批号分别为BWB50892和211017），均购自北京世纪奥科生物技术有限公司，含量均大于98%；乙腈、甲醇均为色谱纯，磷酸、乙醇均为分析纯，水为超纯水。吴茱萸（批号为201101）、人参（批号为20210405）、大枣（批号为210301）分别产于广西、辽宁、新疆，均购自惠州市百姓大药房医药连锁有限公司，生姜（沃尔玛< 广东> 商业零售有限公司港惠新天地店< 惠州> ，批号为202108），经惠州卫生职业技术学院毛一中教授鉴定均为正品。

2 方法与结果

2.1 吴茱萸碱与吴茱萸次碱含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：ThermoODS-2Hypersil柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相：乙腈- 甲醇- 0.1%磷酸水溶液（30∶32∶38，V/V/V）；流速：1 mL/ min；检测波长：225 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别取吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品0.009 9，0.011 2 g，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得混合对照品贮备液，精密吸取2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

供试品溶液：按吴茱萸汤处方及工艺取药材饮片样品（吴茱萸9 g、生姜18 g、人参9 g、大枣12 枚），精密称定。吴茱萸和人参药材饮片样品粉碎，过2号筛；生姜和大枣（去核）切碎，加入70%乙醇（1∶20、m/V，下同）回流提取2 次，每次0.5 h，合并滤液，置3 000 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按吴茱萸汤处方及工艺制备缺吴茱萸的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：取2.1.2 项下3 种溶液各适量，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱在与混合对照品溶液色谱相同保留时间处有相应色谱峰且分离度高，阴性对照无干扰。详见图1。

图1 高效液相色谱图1.Evodiamine 2.Rutecarpine A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密吸取吴茱萸碱及吴茱萸次碱对照品溶液各适量，用甲醇稀释成质量浓度分别为7.9，9.9，19.8，39.6，79.2，198 μg/ mL 和3.58，4.48，11.2，22.4，44.8，89.6 μg/ mL 的系列对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标、待测成分质量浓度（X，μg/mL）为横坐标进行线性回归，得吴茱萸碱回归方程Y1=69.835X1-0.828 7（R2=0.999 9，n=6）和吴茱萸次碱回归方程Y2=60.406X2+59.497（R2=0.999 9，n=6）。结果表明，吴茱萸碱、吴茱萸次碱质量浓度分别在7.9～198 μg/mL 和3.58～89.6 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：分别精密吸取2.1.2项下混合对照品溶液10 μL，按2.1.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积的RSD分别为0.57%和0.86%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批供试品溶液，分别于室温放置0，2，4，8，12，24 h 时按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积的RSD分别为1.13%和1.45%（n= 6），表明供试品溶液室温下放置24 h内稳定。

重复性试验：取同一批药材样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，平行6份，按2.1.1项下色谱条件下进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果吴茱萸碱和吴茱萸次碱的平均含量分别为8.78 mg/g和4.12 mg/g，RSD分别为2.32%和1.83%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批已知含量的处方量药材适量，共9 份，每3 份为1 组，分别加入低、中、高质量浓度的对照品溶液，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.1.4 样品含量测定

取样品适量，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定3 次，记录峰面积，并计算含量。结果吴茱萸碱和吴茱萸次碱的平均含量分别为8.85 mg/g和4.14 mg/g。

2.2 吴茱萸汤提取工艺优选

2.2.1 提取方法考察

按处方量称取药材6 份，采用超声法、乙醇回流法提取时均加入70%乙醇（1∶20，m/V），水煮法提取时加水；提取时间均为1 h，均提取1 次，滤过，置2 000 mL 容量瓶中，分别加70%乙醇或水定容，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。综合评分=吴茱萸碱含量×0.65（权重）+吴茱萸次碱含量×0.35（权重）。结果3种方法综合评分分别为4.69分、5.04分、2.19分，故选择乙醇回流法提取。

2.2.2 正交试验

以乙醇体积分数（因素A）、料液比（因素B）、提取时间（因素C）、提取次数（因素D）为考察因素，以吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量的综合评分为评价指标，采用L9（34）正交试验法优选吴茱萸汤提取工艺。因素与水平见表2，试验设计与结果见表3，方差分析结果见表4。

表2 因素与水平Tab.2 Factors and their levels

表3 L9（34）正交试验设计与结果Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析结果Tab.4 Results of the ANOVA

可见，各因素对综合评分的影响大小依次为A>D>B>C。由表4 可知，4 个因素对结果均无显著影响，从节能增效角度看，最后得吴茱萸汤的最佳提取工艺为A2B3C1D2，即加70%乙醇，料液比为1∶20（m∶V），提取时间为0.5 h，提取2次。

2.2.3 验证试验

取10 倍吴茱萸汤处方量药材，平行3 份，按上述最佳提取工艺参数进行验证试验。结果表明，该工艺稳定可行。详见表5。

表5 验证试验结果（n=3）Tab.5 Results of the verification test（n=3）

3 讨论

3.1 处方药材量选取

吴茱萸汤处方用量，《伤寒杂病论》中记载为“吴茱萸一升（洗，辛热），人参三两（甘温），生姜六两（切，辛温），大枣十二枚（擘，甘温）。上四味，以水七升，煮取二升，去滓”；《方剂学》［11］中记载为“吴茱萸9 g、人参9 g、生姜18 g、大枣12枚”。根据相关临床资料，本研究中选择后一剂量。大枣在处方中无严格定量，且由于市场中红枣大小不一，可能影响料液比，参考文献［12］按单枚红枣（去核）质量3 g，折算本方中大枣质量为36 g。

3.2 色谱条件选择

吴茱萸为方中君药，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻之功，吴茱萸碱和吴茱萸次碱是其活性成分。本研究中对吴茱萸碱和吴茱萸次碱进行全波长扫描，结果发现，吴茱萸碱的最大吸收波长为225 nm，吴茱萸次碱的最大吸收波长为330 nm，在225 nm 波长处也有明显吸收，故选择225 nm 作为检测波长。采用高效液相色谱法测定2 种有效成分含量，预试验中考察不同系统和比例的流动相，如0.1%磷酸水溶液（含十二烷基硫酸钠0.2%）- 甲醇- 乙腈［13］、乙腈水溶液［14］等，最后确定流动相采用乙腈- 甲醇- 0.1%磷酸水溶液（30∶32∶38，V/V/V）。在此条件下，吴茱萸碱和吴茱萸次碱的保留时间短，分离度高，同时能避免其他组分的干扰。

3.3 提取工艺优选

本研究中考察了分别采用超声法、回流法、水煮法对提取效果的影响，结果显示，乙醇回流法提取活性成分含量更高，超声法次之，水煮法最低，与吴茱萸汤活性成分醇溶性较高有关［15］；且方中生姜的主要成分为挥发油性物质，人参和大枣的主要成分为水不溶性物质［16］，水煮法不利于上述活性成分的溶出。故最终采用乙醇回流法提取。

综上所述，本研究中优选的工艺操作简便，结果稳定，可用于吴茱萸汤的提取。