抗炎合剂对脓毒血症大鼠胃肠黏膜屏障功能的影响*

李万义, 阎国良

(上海市中医医院 急诊科, 上海 200071)

脓毒血症(脓毒症)是指由感染引起的全身炎症反应综合征,严重者可导致器官急性功能障碍,诱发脓毒血症性休克［1-2］。消化系统被认为是多器官功能障碍综合征的启动器官和急危重病应激的“中心器官”,有效防治胃肠屏障功能障碍是减少脓毒症患者病死率的关键［3-4］。中医认为脓毒血症属于“温病”“热病”“厥脱证”等范畴,其发病与感受邪毒、毒瘀内阻等密切相关［5-6］,本研究通过建立脓毒血症大鼠模型,探究抗炎合剂对胃肠黏膜屏障的影响,为中医药在临床上的应用提供实验支持。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 72只SD 大鼠,体质量183～219 g、平均(202.97±7.35)g,8周龄,购于上海市中医医院,实验动物使用许可证号SYXK(沪)2020-0014。

1.1.2主要试剂与仪器 抗炎合剂组成:生大黄9 g(后下)、黄芩20 g、黄连6 g、厚朴12 g、败酱草30 g,由上海中医医院提供。头孢哌酮舒巴坦(国药准字H20020598,辉瑞制药有限公司,规格3.0 g),白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及干扰素γ(INF-γ)酶联免疫试剂盒购于上海广锐生物科技有限公司(货号分别为R-811、R-1389及ER5008-1),D-乳酸及胆囊收缩素(CCK)酶联免疫试剂盒均购于上海科顺生物科技有限公司(货号分别为KS13858及KS10747),内毒素(ET)试剂盒购于上海钰博生物科技有限公司(货号yb-E12516),兔抗大鼠紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)及肠上皮咬合蛋白(Occludin)一抗购自美国Abcam公司(货号ab307799及ab216327);EnVision多功能酶标仪(英国铂金埃尔默公司),HM355S全自动轮转式石蜡切片机(上海聚慕医疗器械有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1模型建立与分组 从72只SD大鼠中随机选取18只作为对照组,切开腹腔翻找盲肠后关闭腹腔;其余54只大鼠参考文献［7］采用盲肠结扎穿孔法建立脓毒血症模型,麻醉采用2%戊巴比妥钠按 3 mL/kg腹腔注射,开腹,盲肠根部结扎盲肠、肠系膜血管,穿刺针贯通穿刺3次形成盲肠漏,盲肠还纳并逐层缝合腹腔,术后禁食12 h,自由饮水。术后6 h检测大鼠肛温、心率及呼吸频率,肛温>39 ℃、心率及呼吸频率均升高为建模成功。建模过程中1只大鼠于灌胃过程中死亡, 53只模型大鼠随机分为模型组、抗炎合剂组各18只,阳性对照组17只。

1.2.2药物干预 参照人与大鼠的药物换算系数［8］,所有大鼠均于建模前72 h开始相应药物灌胃至术后6 h判定建模成功:抗炎合剂组大鼠给予抗炎合剂9 mL/(kg·d),生药浓度为1 g/mL;阳性对照组大鼠给予头孢哌酮舒巴坦0.2 g/(kg·d),对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。

1.2.3标本采集 建模后24 h时麻醉所有大鼠,取腹主动脉血5 mL,3 000 r/min离心分离血清、-20 ℃贮存备用;无菌切取回盲部向上2.5 cm肠段冷藏备用,用于检测肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达;另取部分大鼠小肠组织多聚甲醛固定、HE染色观察小肠组织学变化。参考文献［9］称取建模后的大鼠降结肠粪便,计数大肠杆菌及乳酸杆菌菌落数。

1.3 观察指标

1.3.1血清INF-γ、IL-1β及TNF-α、D-乳酸、CCK、ET水平检测 血液样本3 000 r/min离心15 min分离血清,采用酶联免疫法检测血清INF-γ、IL-1β、TNF-α、D-乳酸及CCK水平,采用放射免疫分析法检测ET水平,具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.3.2小肠组织学观察 取“1.2.3”项中固定好的小肠组织,酒精梯度脱水后加入二甲苯溶液进行透明处理、石蜡包埋,切成4 μm的薄片,HE染色后中性树脂封片,于光学显微镜下观察小肠组织学变化。

1.3.3粪便大肠杆菌及乳酸杆菌菌落计数 取100 mg大鼠降结肠粪便加入适量生理盐水,制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7kg/L浓度梯度的混悬液,分别培养24、36 h后计数大肠杆菌及乳酸杆菌菌落数。

1.3.4小肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达 取部分小肠组织,充分研磨、裂解液裂解,BCA法定量蛋白浓度。取样本50 μg,与4倍体积上样缓冲液混合后上样,金属浴5 min,离心取上清,恒压下电泳;湿转至膜,封闭液常温封闭2 h,TBST清洗,加入兔抗大鼠ZO-1、Occludin一抗(1∶500),4 ℃摇床孵育过夜、洗涤,加入山羊抗兔二抗(1∶2 000),室温孵育1 h,暗室中曝光、显影、定影,凝胶成像系统扫描,检测ZO-1、Occludin蛋白表达水平。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 血清INF-γ、IL-1β及TNF-α、D-乳酸、CCK、ET水平

结果显示,模型组大鼠血清INF-γ、IL-1β及TNF-α、D-乳酸、CCK、ET水平水平高于对照组(P<0.05),抗炎合剂组与阳性对照组大鼠血清INF-γ、IL-1β、TNF-α、D-乳酸、CCK、ET水平低于模型组(P<0.05),阳性对照组大鼠血清INF-γ、IL-1β、TNF-α、D-乳酸、CCK、ET水平低于抗炎合剂组(P<0.05),差异有统计学意义。见表1、表2。

表1 各组大鼠血清INF-γ、IL-1β及TNF-α水平比较

表2 各组大鼠血清D-乳酸、CCK、ET水平比较

2.2 粪便中大肠杆菌及乳酸杆菌菌落数

结果显示,模型组大鼠降结肠粪便中大肠杆菌菌落数高于对照组、乳酸杆菌菌落数低于对照组(P<0.05),抗炎合剂组与阳性对照组大鼠降结肠粪便中大肠杆菌菌落数低于模型组、乳酸杆菌菌落数高于模型组(P<0.05),阳性对照组大鼠降结肠粪便中大肠杆菌菌落数低于抗炎合剂组、乳酸杆菌菌落数高于抗炎合剂组(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠降结肠粪便中大肠杆菌及乳酸杆菌菌落数比较

2.3 大鼠小肠组织学观察

结果显示,对照组大鼠小肠组织结构完整,细胞形态正常,无明显的病理学变化;模型组大鼠小肠组织细胞水肿明显,可见大量炎症细胞浸润,部分细胞脱落坏死;抗炎合剂组及阳性对照组大鼠小肠细胞水肿减轻,少量炎症细胞浸润,未见明显的坏死脱落细胞,其中阳性对照组改善程度更明显。见图1。

图1 各组大鼠小肠组织学观察(HE,×200)

2.4 大鼠小肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达

结果显示,模型组大鼠小肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达水平低于对照组(P<0.05),抗炎合剂组与阳性对照组大鼠小肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达水平高于模型组(P<0.05),阳性对照组大鼠小肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达水平高于抗炎合剂组(P<0.05),差异有统计学意义。见表4。

表4 各组大鼠小肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达

3 讨论

脓毒血症是重症医学面临的重要问题,脓毒症目前已成为重症病房内非心血管疾病死亡的主要原因,研究发现,肠黏膜在脓毒症中发挥重要作用,基础研究显示,脓毒症大鼠胃肠黏膜会受到不同程度的损伤［10-11］。胃肠黏膜屏障包括:机械、化学、免疫、微生物等4大屏障,任何一道屏障的破坏或损伤都有可能引起脓毒血症加重甚至死亡［12］。研究结果表明,胃肠黏膜屏障是预防脓毒血症发生发展的重要因素,一般情况下,胃肠黏膜屏障功能障碍越重提示病情越重、预后越差［13］。胃肠屏障功能障碍可进一步引发全身炎症反应综合征及多器官功能障碍综合征,因而研究胃肠屏障功能并改善其功能对于脓毒症的治疗具有重要的临床价值。抗炎合剂的组方为大黄、黄芩、黄连、厚朴、败酱草,组方配伍特点为苦寒并用以清热,通腑活血以排毒,本研究旨在探究抗炎合剂对脓毒血症胃肠道黏膜屏障功能的影响［14］。

研究认为,脓毒血症会导致肠组织多项功能障碍,造成肠黏膜机械、化学、免疫、微生物屏障损伤,通透性增高,胃肠蠕动减弱,胃肠道内微生物环境恶化,细菌代谢产物入血,免疫受损。分析原因为,脓毒血症患者胃肠道消化排空功能减弱,以大肠杆菌为主的条件致病菌将过度聚积并大量繁殖,破坏正常的微生物环境,与厌氧菌争夺营养,一定程度上影响乳酸杆菌的繁殖［15-16］。中医学认为苦寒药物药性寒凉,苦能燥湿伤阴,寒能伤阳,苦寒中药进入机体时,在肠道内不可避免与肠道菌群相互作用［17-18］。研究发现苦寒中药不仅对生理性肠道菌群结构有影响,还对病理性肠道菌群结构有调节作用［19］。本研究结果显示,抗炎合剂组大鼠大肠杆菌菌落数明显降低,乳酸杆菌菌落数明显恢复,说明抗炎合剂可改善肠道菌群数量。现代临床药理学和基础研究证实,大黄等可清除肠道内的细菌ET,抑制细胞因子的分泌,阻断全身炎症反应,减轻病理过程,并加强胃肠营养的支持,有利胃肠道功能的恢复,加速病情好转［20-21］。黄连可调节药源性小鼠肠道菌群失调症,肠道中乳杆菌、双歧杆菌等有益菌数量明显增多［22］。黄芩苷能够调节细菌物种丰度、多样性指标以及乳杆菌数目,促进有益细菌的生长,调节肠道微生物环境［23-24］。黄连、黄芩、大黄等苦寒中药进入机体时,在肠道内不可避免与肠道菌群相互作用,本研究使用的抗炎合剂主要成分为生大黄、黄芩、黄连等,结果与上述研究相符,特别是综合用药更能够抑制炎症反应,改善胃肠功能,调节肠道菌群结构,对脓毒症大鼠的小肠组织起到一定的保护作用。

ET是反映肠道屏障功能的重要指标,当肠道黏膜上皮完整性被破坏时将移位进入血液循环,导致全身炎症反应。肠道上皮细胞连接是否紧密与胃肠黏膜屏障功能密切相关［25］。ZO-1具有紧密连接形成的装配平台作用,其通过将细胞骨架与闭锁蛋白连接在一起形成稳定的连接系统,Occludin作为封闭相邻内皮细胞与上皮细胞之间间隙的重要成分,可直接反映胃肠黏膜屏障功能［26］。本研究结果显示,抗炎合剂组血清D-乳酸、CCK、ET水平低于模型组,小肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达水平高于模型组,提示抗炎合剂可有效改善胃肠黏膜屏障功能。

综上所述,抗炎合剂能够改善脓毒血症大鼠炎症反应及胃肠黏膜屏障,维持肠道菌群平衡,对大鼠小肠组织具有一定的保护作用。但其内在机理及疗效尚有待进一步研究。