东北马鹿微卫星CM41S16和CM12S18遗传标记的群体遗传学参数分析*

刘爽, 王一凡, 黄春华,2,3, 刘德芳,3, 张书环,3, 楼迪栋,2,3**

(1.贵州中医药大学 基础医学院, 贵州 贵阳 550025; 2.贵州中医药大学 法医中药毒理学特色重点实验室, 贵州 贵阳 550025; 3.贵州中医药大学 司法鉴定所, 贵州 贵阳 550025)

药食两用鹿血、鹿茸是珍贵的中药材,易被伪制,因此其生物鉴别是重要的鉴定手段之一［1-4］。东北马鹿(Cervuselaphusxanthopygus)是马鹿中养殖开发较多的亚种［5］,但东北马鹿基因组序列信息至今未见报道,造成其遗传标记信息缺失［6-7］,生物鉴别困难,2018—2020年Nóra.Bana和Hengxing Ba等人分别对欧洲马鹿和中亚马鹿的全基因进行测序［8-9］。利用生物信息学比对种间(欧洲马鹿和中亚马鹿)基因组DNA生物信息,可以筛选到亚种东北马鹿有用的DNA遗传标记,即微卫星(Microsatellite)DNA,拟实现对基因组序列信息缺失的东北马鹿的遗传标记开发。微卫星即短串联重复序列(short tandem repeat, STR),是一类由1～6个核苷酸为重复单位组成的重复序列,总长度多在100～300 bp,广泛分布于真核生物和原核生物基因组中,是基因组中两端较为保守和多态性较高的一段序列［10］,具有操作简单、高灵敏度和结果重复性好等优点,广泛应用于物种保护、种群遗传多样性研究,尤其是法医学个体识别和亲权鉴定中;与此同时微卫星也存在一些弊端,当微卫星的序列未知时可在其近缘物种中相互借用［6］,由于不同物种间偶尔会表现出特异性,进而导致引物通用性差。为了更好的对微卫星进行遗传多样性的研究,需要针对特定的物种进行遗传标记的开发。本文基于生物信息分析,利用两种同源马鹿并具有多态性的微卫星遗传标记对我国东北马鹿的血样进行跨种研究,应用法医物证学STR群体遗传学策略应用标准［11-14］,拟开发有效的STR遗传标记,解决我国东北马鹿动物药材的生物识别和真伪鉴别困难等问题。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1生物信息学分析 获取Ba和Bana等［8-9］报道的欧洲马鹿(NCBI编号10790)和中亚马鹿(NCBI编号67319)的基因组信息,利用微卫星识别工具(MIcroSAtellite identification tool,MISA)对两种马鹿进行生物信息分析,获得STR遗传标记信息,筛选可能有多态性的引物20个。

1.1.2马鹿血样 马鹿血样取自吉林省长春市孙氏鹿业,采集鹿茸时收集新鲜血液,共计48份;每份5 mL,抗凝剂柠檬酸盐葡萄糖溶液(anticoagulant citrate dextrose solution, ACD)抗凝,-20 ℃保存。

1.1.3主要设备及试剂 Biometra PCR 仪( Haffman公司,德国),电泳系统(北京君意);Taq 聚合酶(MBI公司,美国),聚丙烯酰胺(Acr)、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)(江苏沃尔森);引物序列合成(上海生工)。

1.2 实验方法

1.2.1DNA提取 模板DNA采用常规5% Chelex-100提取法［15］进行提取,具体步骤如下:(1)取10 μL ACD抗凝全血加1 mL ddH2O混匀裂解红细胞,12 000 r/min离心30 s,离心后弃上清;(2)重复步骤1(2～3次)直至溶液无血色;(3)加5% Chelex-100 500 μL,56 ℃水浴60 min;(4)剧烈振荡10 s,100 ℃水浴8 min,使蛋白变性;(5)剧烈振荡10 s,12 000 r/min 离心30 s,取上清备用。

1.2.2PCR扩增 在200 μL EP管中依次加入:DNA模板1.0 μL(15 mg/L),10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL,超纯水14.0 μL,Taq酶4 U,10×buffer 2.0 μL,dNTP 0.5 μL。将其混匀并置于Biometra PCR 仪进行PCR反应;反应程序为98 ℃ 15 s,95 ℃ 5 s,62.5 ℃ 20 s,72 ℃ 5 s,共32个循环,72 ℃ 15 s,4℃保存。

1.2.3扩增产物的检测 采用聚丙烯酰胺凝胶(T6%C3%)电泳检测,PCR产物上样量为1.5 μL,50 bpDNA ladder的上样量为1 μL,电泳缓冲液为0.5×TBE,PCR产物于10 V/cm的电场,电泳时间为2.5 h,电泳结束后于溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)染色15 min,采用北京君意凝胶成像分析系统(JY04S-3C)拍照并分析结果。

1.2.4群体遗传学多态性调查及统计学分析 分析PCR的扩增条带,筛选扩增效果良好并且PCR产物长度大小有差异、具有多态性的微卫星引物在48个马鹿血样DNA样本中进行多态性的调查;聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后,将PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化测序,使用Chormas分析软件对测序结果与原始设计序列进行分析验证;并根据张苏云等［16］报道的相关计算公式,计算基因型频率、等位基因频率、多态性信息含量(polymorphism information content,PIC)、个体识别率(discrimination power,DP)等多态性参数。

2 结果

2.1 生物信息学分析及PCR扩增情况

两种马鹿基因组信息比对,发现STR在两种马鹿中存在保守的侧翼序列,并随机挑取合成了20对微卫星引物。将上述引物通过PCR-PAGE实验,验证得出有10对微卫星引物有阳性扩增产物,引物序列信息见表1;在阳性扩增产物中重复单位为二碱基的比例占80%(8/10),三碱基和五碱基各占10%(1/10),扩增结果显示CM41S16(三碱基重复)和CM12S18(五碱基重复)可能具有多态性,进一步进行群体多态性研究。见图1。

注：M为50 bp DNA ladder,1～2为东北马鹿2个无亲缘关系的样品。

表1 10对阳性扩增的微卫星预测序列及引物序列信息

2.2 PCR产物测序结果

对CM41S16和CM12S18基因座进行多态性检测,发现具有高度多态性,并且测序结果与预测序列一致。见图2,表2。

图2 CM41S16和CM12S18测序峰

表2 CM41S16和CM12S18等位基因测序结果

2.3 CM41S16和CM12S18 群体遗传学参数调查

通过对群体遗传学参数调查发现,CM41S16基因座的等位基因为5个,PIC为0.6206,DP为0.8396;CM12S18基因座的等位基因为5个,PIC为0.7212, DP为0.9035,累积个体识别率为98.5%。2个基因座群体遗传学多态性参数见表3～表5。

表5 2个STR基因座的群体遗传学参数

3 讨论

目前微卫星分子标记在物种的种质资源鉴定、分子辅助育种及遗传多样性研究方面广泛应用,但是大部分没有从法医学标准进行系统性研究,这也造成了物种的鉴定应用缺乏标准化认识。张苏云等［16］利用微卫星分析新疆塔里木马鹿的遗传多样性,遗传学参数只计算等位基因数和杂合度等,缺少个体识别率等重要参数;张沼等［13］在内蒙古赛罕乌拉自然保护区东北马鹿种群遗传多样性与性别结构分析中只提到杂合度和多态信息含量这两个参数,没有对基因型频率、等位基因频率和个体识别率等参数进行计算。关于群体遗传学参数的计算缺少标准化,本研究始终以法医学标准,采用微卫星对鹿血生物检材进行群体遗传学研究,为鹿药材的生物识别得到更好的应用提供依据。

人类微卫星遗传标记在真核生物基因组分布广泛,因样品微量、结果准确和操作简单等优点被广泛应用［17-20］,成为个人识别和亲权鉴定的有效生物工具［21-25］。东北马鹿因其基因组信息缺失,本研究通过比对同源跨种欧洲马鹿和中亚马鹿基因组信息,筛选了10对有效的东北马鹿微卫星基因座引物,并获取了2个微卫星基因座的多态性信息,通过测序验证微卫星核心序列特征,结果显示扩增稳定性好,重复序列符合简单重复结构核心序列特征。PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳处理后,条带清晰,分型结果稳定,分型易数字标准化。CM41S16检出5个等位基因(7～11),频率最高的等位基因为8; CM12S18检出5个等位基因(1～5),频率最高的等位基因为5。CM41S16和CM12S18基因座等位基因频率分布好,PIC值分别为0.620 6和0.721 2,DP分别为0.839 6和0.903 5,这些群体遗传学参数表明这2个基因座具有很好的遗传多态性和个体识别能力,鉴于中国东北马鹿的养殖数量不足万计,本研究 CM41S16和CM12S18 2个基因座有足够的群体生物鉴别能力。在东北马鹿鹿药材的生物识别应用中具有较高的实用价值。因中国东北马鹿养殖种群数量较小,故本研究群体数量偏小,造成基因频率偏低的等位基因不能调查计算在内,可按照稀有等位基因,频率以该基因座最小的等位基因频率取值。