miR-299-5p靶向SP1对帕金森模型细胞凋亡的作用及机制*

张烨君, 李倩, 娄展, 聂晓慧, 宋婕

(河北北方学院附属第一医院 神经内三科, 河北 张家口 075000)

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种运动能力异常的神经系统疾病,已成为第二常见的慢性和全身性神经退行性疾病,仅次于阿尔茨海默病［1］。PD的主要特征是黑质多巴胺能神经元的丢失,从而导致神经元信号失调,最终导致运动障碍［2］。PD的发病机理尚不完全清楚,但普遍认为与多巴胺能神经元丧失、氧化应激、线粒体功能障碍及蛋白质聚集有关［3-4］。微小RNA(microRNA,miRNA)是高度保守的小型非编码RNA,miRNA在多巴胺能神经元的功能以及神经退行性疾病的病理生理中有重要的作用［5-6］。miRNA-299-5p(miR-299-5p)位于染色体14q32.31上的印迹Dlk1-Dio3区,研究表明miR-299-5p可抑制神经元自噬和细胞凋亡、改善阿尔茨海默病小鼠的认知能力［7］;Tolosa等［8］研究表明miR-299-5p在PD患者中的表达下调,但miR-299-5p对PD的作用机制尚不清楚。本研究主要探讨miR-299-5p通过靶向特异性蛋白1(specificity protein 1,SP1)对PD模型细胞凋亡的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1动物及细胞来源 10周龄雄性C57BL/6小鼠,体质量20～25 g,购自河北省实验动物中心［许可证号SCXK(冀)2018-004］,于湿度为(50±10)%、温度为(22±3)℃、12 h/12 h的明暗环境中单独饲养,自由饮食;研究获得医院动物护理和使用委员会批准(IACUC20200320008)。人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y购自美国典型培养物保藏中心,置于10% 胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)、 37 ℃及5% CO2环境中培养。

1.1.2主要试剂 miR-299-5p过表达腺病毒载体(adenovirus miR-299-5p,Ad-miR-299-5p)和SP1过表达腺病毒载体(adenovirus-SP1,Ad-SP1)及相对应的阴性对照载体(adenovirus negative control,Ad-NC),miR-299-5p模拟物(miR-299-5p mimic)及其阴性对照(miR-negative control,miR-NC),SP1表达质粒(pcDNA-SP1,pc-SP1)及其阴性对照质粒(pcDNA-negative control,pc-NC),均由北京奥科生物科技有限公司设计并合成;1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-hydrochloride,MPTP;纯度≥98%,上海联硕生物科技有限公司),1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+;纯度≥99%,北京谨明生物科技有限公司);末端脱氧核苷酸转移酶-生物素缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-biotin nick end-labeling,TUNEL)试剂盒(深圳市子科生物科技有限公司),二辛宁可酸(bicinchoninic acid,BCA)试剂盒(上海易色医疗科技有限公司);所有抗体均购自上海艾博抗生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1造模前处理 46只C57BL/6小鼠使用异氟烷深度麻醉后固定在小鼠脑立体定位仪上,暴露颅骨表面。按照图谱定位右侧侧脑室(前囟-2 mm,中线旁开2 mm,深 3 mm)、并埋管。造模前2 d,使用5 μL Hamilton 微量注射器(33 号针头)进行注射,40只小鼠右侧侧脑室注射20 nmol/L腺病毒载体量,6只作为对照组小鼠注射等体积人工脑脊液。

1.2.2造模及分组 取6只C57BL/6小鼠腹腔注射0.9%无菌生理盐水作为对照组,另取40只C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP 30 mg/kg,1次/d,连续7天［9］;最后1次MPTP注射后第0、1、3、5及7天随机选取8只小鼠断头处死,切除腹侧中脑,储存于-80 ℃供后续PD小鼠中脑组织miR-299-5p和SP1的表达量检测实验 。另取42只C57BL/6小鼠随机均分为对照组、PD组、PD+Ad-NC组、PD+Ad-miR-299-5p组、PD+Ad-SP1组、PD+Ad-miR-299-5p+Ad-NC组及PD+Ad-miR-299-5p+Ad-SP1组,除对照组小鼠腹腔注射0.9%无菌生理盐水外,其余组小鼠腹腔注射MPTP制作PD模型;造模完成后,断头处死小鼠取中脑,每组3只小鼠中脑用于分子生物学分析、另3只小鼠中脑固定于4%多聚甲醛溶液供后续实验。

1.2.3细胞分组及转染 SH-SY5Y 细胞用 0.25、0.50 或 1.00 mmol/L MPP+处理24 h 建立体外 PD 细胞模型,取对数期生长的SH-SY5Y细胞随机分为空白组、MPP+组、MPP++mimic-NC组、MPP++miR-299-5p mimic组、MPP++pc-NC组、MPP++pc-SP1组、MPP++miR-299-5p mimic+pc-NC组及MPP++miR-299-5p mimic+pc-SP1组,利用Lipofectamine 2000转染试剂盒按照分组将对应质粒转入SH-SY5Y细胞,0.50 mmol/L MPP+溶液处理24 h。

1.2.4小鼠中脑组织及 SH-SY5Y 细胞中miR-299-5p和SP1 RNA的表达 取“1.2.2”项下MPTP注射后第0、1、3、5及7天和对照组、PD组、PD+Ad-NC组、PD+Ad-miR-299-5p组小鼠中脑组织及“1.2.3”项下 0.50 mmol/L MPP+处理24 h的空白组、MPP+组、MPP++mimic-NC组及MPP++ miR-299-5p mimic组SH-SY5Y细胞,用 TRIzol 试剂提取各组小鼠中脑组织和SH-SY5Y 细胞的总 RNA,使用 SMA 400 UV检测分离 RNA 的浓度和纯度;使用逆转录系统试剂盒从 RNA 样品中合成cDNA。SP1和miR-299-5p的实时 PCR 分别使用标准的 SYBR Green PCR 试剂盒和 TaqMan miRNA 检测在 CFX96 实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)系统上进行,以GAPDH或U6为内参,通过 2-ΔΔCt方法计算;定量 PCR 的反应条件为95 ℃ 10 min,95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s 循环 45 次;miR-299-5p上、下游引物序列为5′- GACCAAAGTGCCTCCCTTTA-3′和5′- CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′,U6上、下游引物序列为5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,SP1上、下游引物序列为5′- TGGTGGGCAGTATGTTGT-3′和5′-GCTATTGGCATTGGTGAA-3′,GAPDH上、下游引物序列为5′-TGCCATCACCATCTTCCA-3′和5′- CATCACGCCACAGTTTCC-3′。

1.2.5小鼠中脑组织中的细胞凋亡 取“1.2.2”项下对照组、PD组、PD+Ad-NC组、PD+Ad-miR-299-5p组、PD+Ad-miR-299-5p+Ad-NC组及PD+Ad-miR-299-5p+Ad-SP1组小鼠中脑组织,4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋并切片及TUNEL染色,每张切片随机选取5 个不交叉重复的视野,观察细胞核中有棕黄色颗粒的凋亡细胞,计算神经细胞凋亡率［细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%］。

1.2.6SH-SY5Y细胞凋亡率 取“1.2.3”项下空白组、MPP+组、MPP++mimic-NC组、MPP++miR-299-5p mimic组、MPP++miR-299-5p mimic+pc-NC组及MPP++miR-299-5p mimic+pc-SP1组的对数生长期细胞,2 500 r/min离心5 min,膜联蛋白V缓冲液重悬;加 FITC标记的膜联蛋白V和碘化啶5 μL,避光孵育15 min,采用流式细胞仪BD FACS Diva软件V6.1.3进行分析细胞凋亡率。

1.2.7活化胱天蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、SP1、PTEN、p-AKT/t-AKT及p-mTOR/mTOR的表达 取“1.2.2”项下对照组、PD组、PD+Ad-miR-299-5p组、PD+Ad-miR-299-5p+Ad-SP1组小鼠中脑组织和对数生长期的空白组、MPP+组、MPP++miR-299-5p mimic组、MPP++miR-299-5p mimic+pc-SP1组的SH-SY5Y细胞,使用NP-40裂解缓冲液提取小鼠中脑或SH-SY5Y细胞的总蛋白样品,用Bradford蛋白测定试剂盒测定蛋白样品的浓度。蛋白质样品用10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,转至聚偏二氟乙烯膜;5% 脱脂乳室温封闭1 h,兔来源的单克隆一抗(Cleaved Caspase-3 1∶1 000、SP1 1∶800、PTEN 1∶1 000、p-AKT 1∶1 500、t-AKT 1∶1 500、p-mTOR 1∶1 000及mTOR 1∶1 000)于4 ℃过夜;与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二级单克隆抗体(1∶2 000)于37 ℃下孵育1 h,用电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)成像,FluorChem HD2凝胶成像系统观察蛋白条带。以GAPDH为内参,使用Quantity One软件进行分析目标蛋白质的相对表达水平。

1.2.8双萤光素酶报告检测靶向关系 收集生长至对数期的SH-SY5Y细胞,接种于24孔板中,37 ℃的5%CO2培养箱培养24 h;1 μg PGL3- SP1-WT(SP1野生型)或PGL3- SP1-MUT(SP1突变型)及miR-NC或miR-299-5p mimic和PRL-CMV质粒共转染入SH-SY5Y细胞,转染48 h,裂解15 min,双萤光素酶检测系统测量萤光素酶的相对活性［萤光素酶的相对活性(R/F)=萤火虫萤光素酶活性/肾萤光素酶活性］。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-299-5p和SP1的表达

qRT-PCR检测结果显示,与对照组相比,腹腔注射MPTP后的第0、1、3、5及7 d PD小鼠中脑组织中miR-299-5p表达下调,SP1表达上调(P<0.01);体外实验结果显示,与空白组相比,0.25、0.50、0.75及1.00 mmol/L MPP+组SH-SY5Y细胞中miR-299-5p表达下调,SP1表达上调(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 各组PD小鼠中脑组织和SH-SY5Y细胞中miR-299-5p和SP1的表达

2.2 细胞凋亡、miR-299-5p及Cleaved Caspase-3表达

小鼠中脑组织中,PD组miR-299-5p表达较对照组下调(P<0.01),PD+Ad-miR-299-5p组miR-299-5p表达较PD组上调(P<0.01),PD组细胞凋亡、Cleaved Caspase-3表达较对照组增加(P<0.01),PD+Ad-miR-299-5p组细胞凋亡、Cleaved Caspase-3表达较PD组减少(P<0.01,图1和图2);SH-SY5Y细胞中,MPP+组miR-299-5p表达较空白组下调(P<0.01),MPP++miR-299-5p mimic组细胞miR-299-5p表达较MPP+组上调(P<0.01),MPP+组细胞凋亡、Cleaved Caspase-3表达较空白组增加(P<0.01),MPP++miR-299-5p mimic组细胞凋亡、Cleaved Caspase-3表达较MPP+组减少(P<0.01);差异均有统计学意义(见图3和图4)。

注：A为TUNEL检测小鼠中脑组织细胞凋亡 (TUNEL染色,×200),B为各组细胞凋亡率统计结果,C为qRT-PCR检测miR-299-5p相对表达;(1)与对照组比较,P<0.01;(2)与PD组比较,P<0.01。

注：A为Western blot检测Cleaved Caspase-3的表达,B为Cleaved Caspase-3相对表达量;(1)与对照组比较,P<0.01;(2)与PD组比较,P<0.01。

注：A为流式细胞数检测细胞凋亡,B为各组细胞凋亡率统计,C为qRT-PCR检测miR-299-5p相对表达;(1)与空白组比较,P<0.01;(2)与MPP+组比较,P<0.01。

注：A为Western blot检测Cleaved Caspase-3的表达,B为Cleaved Caspase-3相对表达量;(1)与空白组比较,P<0.01;(2)与MPP+组比较,P<0.01。

2.3 miR-299-5p和SP1的靶向关系

Targetscan软件预测结果表明,miR-299-5p与SP1具有靶向关系,在3′UTR区存在结合位点;双萤光素酶报告实验结果显示,miR-299-5p mimic与PGL3- SP1-WT共转染明显降低了萤光素酶活性(P<0.01);PD+Ad-SP1组小鼠中脑组织中SP1蛋白表达较PD+Ad-NC组明显上调(P<0.01),PD+Ad-miR-299-5p+Ad-SP1组则较PD+Ad-SP1组明显下调(P<0.01),差异有统计学意义;MPP++pc-SP1组SH-SY5Y细胞中SP1蛋白表达较MPP++pc-NC组明显上调(P<0.01),MPP++ miR-299-5p mimic+pc-SP1组则较MPP++pc-SP1组明显下调(P<0.01),差异有统计学意义。见图5。

注：A为miR-299-5p与SP1 3′UTR区的结合位点,B为荧光素酶活性,C为Western blot检测小鼠中脑组织中SP1蛋白表达,D为各组小鼠中脑组织中SP1蛋白相对表达量,E为Western blot检测SH-SY5Y细胞中SP1蛋白表达,F为各组SH-SY5Y细胞中SP1蛋白相对表达量;(1)与mimic-NC组比较,P<0.01;(2)与PD+Ad-NC组比较,P<0.01; (3) 与PD+Ad-SP1组比较,P<0.01;(4)与MPP++pc-NC组比较,P<0.01; (5) 与MPP++pc-SP1组比较,P<0.01。

2.4 SP1过表达对细胞凋亡和 Cleaved Caspase-3表达的影响

PD+miR-299-5p+Ad-SP1组小鼠中脑组织中细胞凋亡、Cleaved Caspase-3表达较PD+Ad-miR-299-5p+Ad-NC组增加(P<0.01,图6);MPP++miR-299-5p mimic+pc-SP1组SH-SY5Y细胞凋亡、Cleaved Caspase-3表达较MPP++miR-299-5p mimic+pc-NC组增加(P<0.01,图7)。

注：A为TUNEL检测小鼠中脑组织细胞凋亡(TUNEL染色,×200),B为各组细胞凋亡率统计结果,C为Western blot检测小鼠中脑组织中Cleaved Caspase-3的表达,D为Cleaved Caspase-3相对表达量;(1)与PD+Ad-miR-299-5p+Ad-NC组比较,P<0.01。

注：A为流式细胞术检测细胞凋亡,B为各组细胞凋亡率统计,C为Western blot检测的表达Cleaved Caspase-3,D为Cleaved Caspase-3相对表达量;(1)与MPP++miR-299-5p mimic+pc-NC组比较,P<0.01。

2.5 PTEN/AKT/mTOR通路蛋白的表达

小鼠中脑组织结果显示(图8):与对照组相比,PD组小鼠中脑中PTEN表达上调(P<0.05),p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表达水平下调(P<0.05);与PD组相比,PD+Ad-miR-299-5p组小鼠中脑PTEN表达下调(P<0.05)、p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表达水平上调(P<0.05);与PD+Ad-miR-299-5p组相比,PD+Ad-miR-299-5p+Ad-SP1组小鼠中脑PTEN表达上调(P<0.05)、p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表达水平下调(P<0.05)。 SH-SY5Y细胞结果显示(图9):与空白组相比,MPP+组PTEN表达上调(P<0.05)、p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表达水平下调(P<0.05);与MPP+组相比,MPP++miR-299-5p mimic组PTEN表达下调(P<0.05)、p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表达水平上调(P<0.05);与MPP++ miR-299-5p mimic组相比,MPP++miR-299-5p mimic+pc-SP1组PTEN表达上调(P<0.05)、p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表达水平下调(P<0.05)。

注：A为Western blot检测各组小鼠中脑组织中PTEN/AKT/mTOR通路蛋白的表达,B为PTEN/AKT/mTOR通路蛋白相对表达量;(1)与对照组比较,P<0.05;(2)与PD组比较,P<0.05;(3)与PD+Ad-miR-299-5p组比较,P<0.05。

注：A为Western blot检测各组SH-SY5Y细胞中PTEN/AKT/mTOR通路蛋白的表达,B为PTEN/AKT/mTOR通路蛋白相对表达量;(1)与空白组比较,P<0.05;(2)与MPP+组比较,P<0.05;(3)与MPP+ +miR-299-5p mimic组比较,P<0.05。

3 讨论

PD是第二常见的神经退行性疾病,其特点是进行性运动迟缓、震颤、僵硬及姿势不稳［10］。中脑黑质多巴胺能神经元的丢失和死亡被认为是PD主要运动症状的主要原因［11］。MPTP具有很高的脂溶性和进入脑内的能力,可以被位于胶质细胞外膜的单胺氧化酶B催化产生MPP+［12］。 MPP+是线粒体氧化呼吸链复合物Ⅰ的特异性抑制剂,可降低ATP的生成,诱导多巴胺能神经元(dopaminergic neuron,DA)凋亡［13-14］。 因此,MPTP和MPP作为一种典型的神经毒素,在体内外建立PD模型已有大量研究。许多miRNA参与如PD等神经退行性疾病中各种生物学和病理学过程的调节,如PD患者体细胞和DA中miR-9-5p、miR-30、miR-29、let-7、miR-485、miR-26及miR-299-5p表达异常［8,15-16］。本研究采用MPTP诱导PD小鼠,MPP+诱导SH-SY5Y细胞PD模型,研究发现在体内外PD模型中miR-299-5p表达下调,SP1表达上调,细胞凋亡率增加,Cleaved Caspase-3表达上调;miR-299-5p过表达抑制MPTP诱导的PD小鼠模型中脑和MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,并下调Cleaved Caspase-3的表达。

miRNA通过与靶基因的3'-UTR结合,通过影响基因mRNA的翻译和循环而抑制蛋白质编码,参与包括PD在内的多种疾病的发病机制［17］。SP1是特异性蛋白/Kruppel样因子家族的成员,有助于调节细胞生长和凋亡［18］。已有研究表明,miR-375上调可通过抑制SP1改善PD多巴胺能神经元的损伤,减轻氧化应激和炎症反应［19］;miR-29c在PD模型中通过靶向SP1在体内和体外减轻炎症和细胞凋亡［20］。本研究表明,miR-299-5p靶向下调SP1,SP1过表达逆转miR-299-5p对MPTP诱导的PD小鼠中脑和MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡、Cleaved Caspase-3的调节作用,说明miR-299-5p通过靶向下调SP1抑制MPTP诱导的PD小鼠模型中脑和MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,并下调Cleaved Caspase-3的表达。

PTEN/AKT/mTOR通路在调控细胞分化、存活及凋亡等过程中具有重要的作用,适当调节该通路可对抗神经元凋亡,改变PD等神经退行性疾病发展［21-22］;PTEN是活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生和神经元死亡的重要介质,可成为神经退行性疾病的潜在治疗靶点［22］;PTEN通过影响AKT/mTOR信号通路参与PD过程,如miR-181b通过靶向PTEN/AKT/mTOR信号通路调控PD模型中的自噬［23］;miR-410通过抑制PTEN/AKT/mTOR信号通路,在6-羟多巴胺诱导的PD细胞模型中发挥神经保护作用［24］;SOS1内含子转录物1(SOS1 intronic transcript 1,SOS-IT1)通过调节miR-124-3p/PTEN/AKT/mTOR通路参与MPP+诱导的神经元损伤［25］。本研究结果显示,MPTP诱导的PD小鼠中脑组织和MPP+处理的SH-SY5SY细胞中PTEN蛋白的表达均明显增加,p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表达水平下调;过表达miR-299-5p使PD模型小鼠和MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中PTEN表达下调,p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表达水平上调;过表达SP1可逆转miR-299-5p对MPTP诱导的PD模型小鼠中脑和MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中PTEN/AKT/mTOR通路蛋白的表达调控作用。

综上所述,miR-299-5p 通过靶向SP1对MPTP诱导的PD小鼠中脑组织和MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡发挥抑制作用,这与PTEN/AKT/mTOR通路有关,因此提示miR-299-5p和SP1可作为治疗PD的有效靶标。