清肾颗粒对腺嘌呤致肾纤维化大鼠Nrf2/ARE 信号通路及氧化应激的干预作用*

陈诺，金华，呼琴，王亿平，刘敏，张叶青

1 安徽中医药大学研究生院 安徽合肥 230012

2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）已经成为一个严重威胁人类健康的重要疾病。CKD 的病理基础是肾小球硬化和肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF），最终导致终末期肾脏病（End-stage renal disease，ESRD）的出现。氧化应激在CKD 病情进展中扮演十分重要的角色，是RIF 发生的重要病理机制[1]。Nrf2/ARE 信号通路在抗炎、抗氧化、抑制细胞死亡和促进血管生成中发挥重要作用，是体内内源性抗氧化系统的活性通路，有望为肾病的诊断和治疗提供新的靶标[2]。

中医药在治疗慢性肾衰竭等慢性疾病方面具有显著疗效，可有效延缓其进展[1]。清肾颗粒是安徽省名中医、安徽省中医药领军人才王亿平教授的临床基础经验方。前期临床研究已证实[1，3]，CKD 湿热证患者体内氧化应激反应显著增强，清肾颗粒不但具有清热化湿祛瘀功效，而且可以抑制CKD 患者的氧化应激，增强抗氧化能力，进而延缓肾纤维化的进展。为进一步了解清肾颗粒在肾纤维化中的作用，本研究通过腺嘌呤诱导大鼠肾纤维化，通过Nrf2/ARE 途径阐明其作用机理。

材料与方法

1 材料

1.1 实验动物 2 月龄SPF 级雄性SD 大鼠50 只，体质量（200±10）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证号：SCKX（京）2019-0010，NO.110324210103597984。动物相关处置均符合《中华人民共和国实验动物管理条例》要求。

1.2 实验药物与试剂 清肾颗粒由生大黄、茵陈、黄连、白花蛇舌草、丹参、泽泻等药物组成，由安徽中医药大学第一附属医院院内制剂（皖药制字BZ20080011），10g/袋（约含生药34g）。

1.3 主要试剂 腺嘌呤购自Solarbio；SCr、BUN、UA试剂盒均购自南京建成生物工程研究院；PBS 试剂购自Hyclone；ROS 购自碧云天；兔抗Nrf-2 抗体购自Bioss；GAPDH 购自Zsbio；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG 购自Zsbio。

2 方法

2.1 造模 选用SPF 级SD 大鼠50 只，在7d 内进行适应性饲养，将其随机分为正常组、模型组、清肾颗粒低、中、高剂量组，每组10 只。除正常组之外，其他各组大鼠均建立腺嘌呤肾纤维化模型。在100ml 生理盐水中加入2.5g 的腺嘌呤，制成浓度为2.5%悬浮液，灌胃给药，剂量为200mg·kg-1·d-1（即0.8mL·100g-1·d-1）。腺嘌呤容易沉淀，所以在灌胃操作中，一定要将腺嘌呤悬浊液混合均匀，以备随时使用。正常组大鼠连续28d 每日给予相同剂量生理盐水灌胃1 次。

2.2 分组及给药 从造模后第1 天开始，每天以4mL给药1 次，持续12 周。清肾颗粒高、中、低剂量组分别 按16.0g·kg-1·d-1、8.0g·kg-1·d-1、4.0g·kg-1·d-1的 剂量灌胃，而正常组和模型组则给予同等剂量的生理盐水。

2.3 动物取材方法 在最后1 次给药12h 后，每组大鼠用2.5mL·kg-12%戊巴比妥钠麻醉，并将其置于手术台上，打开腹腔，于腹主动脉无菌采血，离心并分离血清，取血清，于-80℃下贮存，测定SCr，BUN，UA 等各项指标。切除大鼠双肾并记录重量，修剪组织，并于0.9%的生理盐水中清洗，分离后一部分肾组织并迅速放入液氮中，随后移至-80℃的冰箱中保存，蛋白含量通过Western blot 测定。剩余肾脏置于4%多聚甲醛内保存，做好病理学检查的准备。采集各组大鼠标本后，处死并放于医疗垃圾袋中，将其送交安徽中医药大学科研实验中心进行集中处置。

2.4 肾脏组织病理学检查 由专业技术人员指导制备肾脏组织石蜡切片，根据 HE、MASSON 的试剂盒说明书进行染色。封片后，用光学显微镜观察肾脏组织的病理变化程度。

2.5 血生化相关指标检测 取出血清，检测SCr、BUN、UA 等的含量，操作严格按照试剂盒说明书执行。

2.6 肾脏相关指标检测

2.6.1 ROS（活性氧含量）检测 取肾组织细胞，根据活性氧检测试剂盒的说明，用流式细胞术测定活性氧水平。

2.6.2 Western Blot 法检测 称取定量大鼠肾组织，用RIPA 裂解液提取总蛋白。运用BCA 法检测蛋白浓度。主要步骤如下：首先，通过分离凝胶电泳分离蛋白，并转移到PVDF 膜上。转模完毕之后，加入Western 封闭液（5%脱脂奶粉）室温封闭2h；随后加入一抗Nrf2（1∶1000 稀释）、HO-1（1∶500 稀释）、4℃孵育过夜，TBST 洗涤3 次后，室温孵育HRP 标记的兔二抗（1∶20000 稀释）1.2h；使用ECL 发光试剂盒来检测蛋白。采用Image J 软件进行胶片条带的分析。

3 统计学处理

数据处理运用SPSS23.0 进行分析。计量资料用（±s）表示；2 组之间使用t 检验进行比较；运用单因素方差分析进行多组间比较；若数据不符合正态分布或方差不齐则进行非参数检验；采用卡方检验或Fisher 精确概率法对计数资料进行统计。P＜0.05 被视为有统计学意义。

结 果

1 大鼠一般情况

实验过程中由于灌胃不当出血致死2 只，1 只因麻醉药物过量而死亡，1 只死因不明。最终正常组有10 只大鼠、模型组存活8 只、清肾颗粒高剂量组存活9 只、中剂量组有10 只大鼠、低剂量组还剩下9 只。正常组大鼠状态良好，饮食正常，活动好，反应灵敏，体毛光滑有光泽，体重、饮食量以及饮水量正常。正常组大鼠精神、进食、活动、体重、饮食及饮水量均正常、反应敏捷、体毛光亮。模型组大鼠较正常组大鼠精神、进食、活动、体重、饮食及饮水量均不佳，反应迟钝，体毛杂乱黯淡。各治疗组大鼠精神、活动、皮毛状态较模型组大鼠均有明显的改善。

2 各组大鼠肾功能指标的变化

与正常组比较，模型组大鼠BUN、Scr 和UA 浓度均显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，清肾颗粒低、中、高剂量组大鼠BUN、Scr 和UA 浓度均显著下降（P＜0.05）；且清肾颗粒高剂量组的BUN、Scr 和UA浓度显著低于中、低剂量组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠BUN、Scr 和UA 比较（±s）

表1 各组大鼠BUN、Scr 和UA 比较（±s）

组别 只数 Scr/μmol·L-1 BUN/mmol·L-1 UA/μmol·L-1正常组 10 30.29±2.32 5.96±0.23 59.12±4.43模型组 8 99.82±4.30 13.04±0.22 110.10±3.98清肾颗粒低剂量组 9 88.30±2.75 9.19±0.26 97.35±3.45清肾颗粒中剂量组 10 82.29±2.69 8.60±0.28 90.38±2.93清肾颗粒高剂量组 9 78.14±2.90 7.11±0.24 84.89±4.44

3 各组大鼠肾组织中ROS 含量的比较

与正常组比较，模型组大鼠肾组织ROS 含量升高（P＜0.05）。与模型组比较，清肾颗粒低、中、高剂量组ROS 含量均显著下降（P＜0.05）；且清肾颗粒高剂量组的ROS 含量显著低于中、低剂量组（P＜0.05）。见表2、图1。

图1 各组细胞ROS 平均荧光强度比较（±s）相关柱状

表2 各组细胞ROS 平均荧光强度比较（±s）

表2 各组细胞ROS 平均荧光强度比较（±s）

组别 只数 ROS（平均荧光强度）正常组 10 27528.00±725.34模型组 8 70046.00±998.25清肾颗粒低剂量组 9 63924.67±689.77清肾颗粒中剂量组 10 48261.33±1750.50清肾颗粒高剂量组 9 35113.00±1065.53

4 各组大鼠肾组织中Nrf2、HO-1 蛋白表达比较

与正常组比较，模型组大鼠的Nrf2、HO-1 蛋白表达均显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，清肾颗粒低、中、高剂量组大鼠Nrf2、HO-1 蛋白表达均显著升高（P＜0.05）；且清肾颗粒高剂量组的Nrf2、HO-1 蛋白表达程度显著高于中、低剂量组（P＜0.05）。见表3，图2。

图2 各组大鼠蛋白电泳

表3 各组大鼠肾组织Nrf2、HO-1 蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠肾组织Nrf2、HO-1 蛋白表达比较（±s）

分组 只数 Nrf2 HO-1正常组 10 1.13±0.18 1.04±0.05模型组 8 0.11±0.02 0.25±0.13清肾颗粒低剂量组 9 0.21±0.07 0.36±0.13清肾颗粒中剂量组 10 0.40±0.10 0.57±0.05清肾颗粒高剂量组 9 0.60±0.16 0.72±0.01

5 各组大鼠的肾脏病理改变

正常组肾小球、肾小管及肾间质未见异常。模型组正常肾小球数目明显下降数量显著减少，肾小球内可见系膜基质增多和系膜细胞增生，伴有部分肾小球萎缩或代偿性肥大；肾小管萎缩，小管上皮细胞肿胀、脱落，部分管腔有明显扩张，内可见棕褐色腺嘌呤结晶沉积；肾间质增宽，成纤维细胞及胶原纤维增多，单核、淋巴细胞明显浸润，蓝染胶原纤维分布于纤维化区域。各治疗组与模型组比较，上述病理改变有所减轻。见图3。

图3 A 各组大鼠的肾脏病理改变

图3 B 各组大鼠的肾脏病理改变

讨 论

慢性肾衰竭在中国古代文献中并无与之相适应的病名，近代医学文献将其纳入“水肿”“关格”“癃闭”“虚劳”等范畴[4]。诸多医家均把湿热郁滞作为肾病的主因，是慢性肾病的始动因素，因此在治疗中应突出清利湿热[5]。王亿平教授根据慢性肾衰的病机特征自拟“清肾颗粒”，其作用是清热化湿，活血祛瘀[6]。本方中，生大黄泻热逐瘀，荡涤胃肠湿热瘀毒，为君药；白花蛇舌草清热解毒利湿，茵陈清利湿热，黄连清热燥湿，泻火解毒，三药合用共为臣药；佐以茯苓、白术、白豆蔻、薏苡仁、扁豆、猪苓、泽泻、车前草健脾益气、利水渗湿消肿;并辅以益母草和丹参活血化瘀。这些药物合用，具有清热化湿祛瘀之功。

本研究所选择的腺嘌呤诱导CRF 大鼠模型是实验中常用的CRF 动物模型，大鼠长期给予腺嘌呤灌胃可沉积于肾小管及间质引起堵塞，产生类似人类CRF代谢异常，在生物化学和形态学上都与人类CRF 相似，与单侧输尿管梗阻、马兜铃酸肾病等其他肾间质纤维化模型相比较，腺嘌呤大鼠的肾小管损伤更为严重。因此腺嘌呤CRF 模型对肾间质纤维化、慢性间质性肾炎和局灶节段性肾小球硬化的研究有一定的参考价值[7]。血肌酐、尿素氮、尿酸这些肾脏损害的指标在肾功能受损的情况下会在血液中蓄积[8]。在腺嘌呤灌胃后，模型组大鼠血液Scr、BUN 和UA 浓度升高，并且肾组织出现了肾小管萎缩、肾间质纤维化、炎性细胞浸润等病理学变化，提示造模成功。在予不同浓度清肾颗粒后，大鼠血液中Scr、BUN 和UA 明显降低，肾脏组织病理学变化得到改善，表明清肾颗粒具有抗肾脏纤维化作用，与其他研究结论一致［9］。

氧化应激（oxdative stress），指氧化剂（活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、自由基）与抗氧化剂之间的氧化还原平衡失衡[10]。体内氧化与抗氧化系统在正常情况下维持着动态平衡。但是这种平衡状态在机体发生病变时被打破[11]。Patricia Tomás-Simó 等[12]研究发现与健康个体相比，CKD 患者表现出明显更高的氧化应激水平，并且随着eGFR 的下降，这些变化加剧，在CKD 分期之间具有显著差异，并随着病情恶化而增加，同时抗氧化能力下降。前期研究证实[13-14]，活性氧（ROS）通过氧化应激反应介导NF-κB 活化，进而激活炎症因子，诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化和加速肾纤维化大鼠的RIF 进程；清肾颗粒能够通过抗氧化机制，减轻肾小管损伤，抑制肾小管EMT，延缓RIF 进展。

Nrf2-ARE 信号通路是抗氧化应激的经典信号通路。在基础条件下，Nrf2 通过结合其主要抑制剂Keap-1 而保持转录活性，Keap-1 针对Nrf2 进行蛋白酶体降解，维持在细胞质中。在氧化应激环境中，Nrf2与Keap1 从细胞质中分离并向核内迁移，并与Maf 形成异源二聚体（ARE）共同作用，激活Nrf2-ARE 信号途径，从而激活下游的许多保护基因（如血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、对氧磷酶（PON）-1等）的转录，进而抵御各种刺激引起的氧化应激损害[15-17]。此次研究发现，腺嘌呤慢性肾衰竭大鼠肾组织中的总Nrf2、核Nrf2、HO-1 等蛋白表达水平显著降低，考虑Nrf2 激活及其下游抗氧化分子在慢性肾衰竭肾组织中的反常减少。这可能与尿毒症动物对氧化应激和炎症的生物反应能力受损，以及它们对残肾的破坏性后果，这与前期研究结果一致[18-21]。

本研究结果表明，清肾颗粒可降低腺嘌呤肾纤维化大鼠血清中SCr、BUN、UA 含量，减轻肾组织病理损伤；并且还可以显著增加腺嘌呤肾纤维化大鼠肾组织中Nrf2、HO-1 蛋白表达量，提示清肾颗粒具有抗氧化应激的能力，其作用机制可能与Nrf2/ARE 信号通路的激活有关，从而保护肾脏并延缓肾纤维化进程。这为清肾颗粒治疗慢性肾衰竭的临床应用提供科学理论依据。