赤茵合剂治疗慢性乙型肝炎作用机制探讨*

赵芬芬，施卫兵，齐春伟，许文彬，马翠翠，郭锦晨

1 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230012

2 安徽中医药大学 安徽合肥 230031

3 新安医学教育部重点实验室 安徽合肥 230038

慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）是由HBV 病毒持续性感染而发生的慢性肝脏炎性损害病变，会发生不同程度的肝损伤，最终发展为肝硬化、肝癌等，威胁人类生命健康。目前临床上尚无能完全治愈CHB 的特效药[1]，所以抗病毒仍是治疗CHB 的主要方法[2]，但存在耐药风险、不良反应等相关问题，影响疗效，远期预后不佳[3]。

现代中医学认为CHB 是由湿热之邪侵入人体，人体正气不足无力抗邪而起，常将CHB 归于中医学的“胁痛”“黄疸”等中医疾病范畴。赤茵合剂为安徽省中医院的自拟方，曾用名赤茵糖浆，临床应用近30 年，疗效确切。曹承楼等人[4]的研究发现，赤茵合剂对黄疸型病毒性肝炎肝胆湿热型有明显的治疗作用。研究表明，赤茵合剂可有效降低肝内胆汁淤积性黄疸患者血清 ALT、GGT、ALP 的水平，降低肝内胆汁淤积性黄疸患者的血清LN、C-IV 水平，对改善肝组织纤维化也有良好的效果[5]。杨小军、施卫兵、胡大庆等[6-8]人的研究证实了赤茵合剂对慢性乙型黄疸性肝炎、慢性乙型肝炎高胆红素血症及淤胆型乙型肝炎均有良好的治疗效果。然而，赤茵合剂治疗CHB 的作用机制尚未完全明确。本研究基于网络药理学和分子对接的方法，分析赤茵合剂治疗CHB 的有效成分、作用靶点及信号通路，探究赤茵合剂治疗CHB 的潜在作用机制，为临床应用赤茵合剂治疗CHB 提供理论支持。

资料与方法

1 筛选赤茵合剂有效成分及靶点

高口服生物利用度是确定生物分子作为治疗剂的药物样特性的关键性指标，借助中药系统网络药理学数据分析平台（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/），设置筛选条件为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥40%、药物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18，获取赤茵合剂药物活性成分和相对应的靶点，同时采用Uniprot 数据库规范靶点名称。

2 筛选CHB 靶点

进 入GeneCards 数 据 库（https：//www.genecards.org/），将“Chronic hepatitis B”作为关键词进行检索，以得分＞中位数13.60 为标准筛选，通过OMIM 数据库（http：//www.omim.org/）、DrugBank 数据库（https：//go.Drugbank.com/）、TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）及PharmGkb 数据库，将“Chronic hepatitis B”作为关键词，进行检索，得到各数据库相应的CHB 靶点，将五个数据库的靶点合并后去重即为CHB 的靶点。将药物与疾病靶点对比分析，获得赤茵合剂治疗CHB的潜在靶点。

3 构建分析“赤茵合剂-有效成分-潜在靶点-CHB”网络

建立潜在靶点、有效成分相关文件，将其导入Cytoscape3.7.2 软件，构建“赤茵合剂-有效成分-潜在靶点-慢性乙型肝炎”网络，并对网络进行相关分析。

4 构建蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系网络（PPI），筛选核心靶点

借 助STRING 在 线 数 据 库（https：//stringdb.org/），导入潜在靶点，限定研究物种为“Homo sapiens”，进行蛋白质互作分析，置信度设为≥0.400，隐藏游离节点，获得PPI 网络，保存为TSV 文件，并将其导入Cytoscape3.7.2 软件，优化相关网络图，利用MCODE 插件进行聚类，并分析筛选出核心靶点。

5 GO 功能富集和KEGG 通路分析

将“1.2”中的潜在靶点上传至Matescape 数据库（https：//Matescape.ncifcrf.gov/），以“Homo sapiens”为限定条件，进行GO 功能富集和KEGG 通路分析。其中GO 重点了解靶点主要的作用过程，而KEGG 主要了解细胞的生化过程，最后使用微生信将结果可视化。

6 分子对接验证

将核心靶点作为分子对接的受体，在PDB 数据库中下载相应的pdb 格式，运用pymol 软件进行去除水分子和原有配体，得到相应的受体结构；Pubchem 中下载的活性成分的3D 结构作为小分子配体。然后准备PDBQT 文件，根据靶点口袋调整 Gridbox 坐标及大小，采用AutoDock Vina 进行分子对接，借助PyMol、LigPlot+软件进行可视化处理。

结 果

1 赤茵合剂有效成分及靶点与CHB 靶点收集

通过“1”中的条件在TCMSP 数据库检索，收集到有效成分：赤芍17 个，茵陈10 个，丹参43 个，苦参38 个，大黄11 个，葛根3 个，甘草69 个。去除重复成分、剔除无法预测相关靶点的化合物，最终确定赤茵合剂有效成分150 个，将每味中药位于前5 的化合物列出（表1）。通过查阅文献可知芍药内酯苷为赤芍的主要成分，木犀草素为茵陈的主要成分，故将此2 种化合物纳入，通过Pubchem、SwissTargetPrediction 数据库筛选相关靶点，运用Uniport 数据库校正靶点，去除重复基因并删除非人源性靶点。最终得到152 个有效成分，351 个靶点。

表1 赤茵合剂有效活性成分基本信息

进入GeneCards 数据库、OMIM 数据库、DrugBank数据库、TTD 数据库及PharmGkb 数据库，将“chronic hepatitis B”作为关键词，进行检索，将五个数据库的靶点合并去重后获得1113 个与CHB 相关的靶点。

将赤茵合剂有效成分对应的351 个药物靶点与CHB 对应的1113 个疾病靶点进行对比分析后获得127 个共有靶点，即为赤茵合剂作用于CHB 发挥治疗作用的潜在靶点（图1），其中槲皮素（Quercetin）、毛蕊异黄酮（Calycosin）、木犀草素（Luteolin）、山柰酚（Kaempferol）、丹参酮IIA（Tanshinone IIA）、芒柄花黄素（Formononetin）Degree 值排名靠前（图2），认为可能是发挥作用的主要成分。

图1 药物-疾病共同靶点

图2 化合物Degree 值

2 “ 赤茵合剂-有效成分-潜在靶点-CHB”网络的构建及分析

建立潜在靶点、有效成分与中药、疾病的相关文件，将其导入Cytoscape3.7.2，构建“中药-有效成分-潜在靶点-CHB”可视化网络图（图3）。

图3 “赤茵合剂-有效成分-潜在靶点-CHB”网络图

3 PPI 网络构建及核心靶点筛选

将127 个潜在靶点导入STRING 数据库，导出TSV 格式文件，再将其导入Cytoscape3.7.2 软件，利用“Network Analyzer”进行蛋白网络互作分析，构建可视化网络图（图4）。CytoHubba 可以准确地筛选出网络中的重要节点，其中最大集团中心度（maximal cliquecentrality，MCC）算法被证实是预测重要靶点较为精确的方法之一。通过MCC 算法，确定的关键靶点即为赤茵合剂治疗CHB 的核心靶点（图5），并根据degree 值绘制条形图（图6），再运用Cytoscape3.7.2中的MCODE 插件，对交集靶点进行聚类功能模块分析，共得到6 个功能模块（图7A-图7F），并对其进行打分（图8），模块1-3 的MCODE 聚类得分分别为53.5 分、6 分和3.333 分。第一类由65 个靶点组成，是MCODE 集群得分最高的功能模块，该模块的靶基因主要富集在病毒感染、免疫、和癌症相关的通路中；第2 类包含23 个靶点，涉及蛋白质磷酸化、激酶活性的调节、有丝分裂细胞周期相变、凋亡信号通路的调控等生物过程；第3 类包含4 个靶点，与外源代谢和分解过程、雌激素代谢过程、不饱和脂肪酸代谢过程相关。

图4 PPI

图5 核心靶点

图6 核心靶点Degree 值

图7 交集靶点功能模块图

图8 模块评分

4 GO 功能富集分析

利用PANTHER 在线平台，对127 个潜在靶点进行分类（图9），主要包括蛋白质修饰酶、代谢物相互转化酶、细胞间信号分子、跨膜信号受体、基因特异性转录调节因子、蛋白质结合活性调节剂等。运用Matescape 数据库对127 个潜在靶点进行GO 功能富集分析，阈值P 设定为＜0.05，包括了466 条生物过程、55 条细胞组分、107 条分子功能。生物过程（biological process，BP）（图10）分析可以看出这些靶点主要涉及对RNA 聚合酶II 启动子转录的正调控、转录的正调控、基因表达的正调控、凋亡过程的负调控、细胞增殖的正调控、凋亡过程等466 条生物过程。

图9 潜在靶点分类

图10 BP 分析结果（前20 条）

5 KEGG 通路富集分析

运用Matescape 数据库进对127 个潜在靶点进行KEGG 通路富集分析，阈值P设定为＜0.05，得到169 条KEGG 富集结果，包括PI3K-Akt 信号通路、Hepatitis B 信号通路、MAPK 信号通路等通路等，列出相关富集结果的前20 位（表2）。绘制KEGG 靶点-通路图（图11），并对KEGG 通路进行分类（图12），主要包括人类疾病、信息处理过程、细胞过程和组织系统，多与炎症通路和病毒感染通路相关。

图11 KEGG 靶点-通路图

图12 KEGG 通路分类图

表2 KEGG 通路富集分析（前20 条）

6 分子对接分析

将1 中的主要成分包括槲皮素、毛蕊异黄酮、木犀草素、山柰酚、丹参酮IIA、芒柄花黄素作为分子对接的配体，将存3 中的核心靶点作为受体，准备相关文件，采用AutoDock Vina 进行分子对接，同时评定自由结合能（图13-图14）。若自由结合能＜0，表明配体和受体可以自发地结合，若自由结合能≤-5.0 kcal/mol，则说明两者结合较好，若结合能≤-7.0 kcal/mol，则说明两者结合较强[9]。本研究选取≤-7.0 kcal/mol的对接结果，使用PyMol、LigPlot+软件，将结合能前6位的对接结果制作2D 对接示意图（图15）。由图13可知，所有的自由结合能均≤-5.0 kcal/mol，由图14可见，自由结合能≤-7.0 kcal/mol 占比63%，说明槲皮素、毛蕊异黄酮、木犀草素、山柰酚、丹参酮IIA、芒柄花黄素与核心靶点均能自发结合，且有较好的结合活性，且大部分均具有较强的结合活性。

图13 自由结合能评分

图14 自由结合能比例图

图15 分子对接2D 模型图

讨 论

CHB 是世界医学界公认的难题，具有传染性，尚不能完全治愈，容易发展成肝硬化、肝癌。目前主要以抗病毒治疗为主，但长期单一使用抗病毒药物容易产生不良反应。越来越多的临床研究表明，中医药在改善慢乙肝患者临床症状、保肝降酶、抗肝脏纤维化、调节免疫等方面具有独特优势[10]。赤茵合剂由茵陈蒿汤化裁而来，其组成包括赤芍、茵陈、丹参、葛根、苦参、大黄、生甘草7 味中药，其中赤芍、茵陈同入肝经，共为君药，清肝胆之湿，泄血分郁热；丹参、葛根为臣药，以宣畅气机，通络活血，佐以苦参、大黄，燥湿解毒，通腑散瘀；以甘草为使，淸热解毒、调和诸药。诸药合用，共奏清热利湿、解毒保肝之效。

本研究采用网络药理学研究方法分析预测赤茵合剂治疗CHB 的作用机制，通过筛选共预测出赤茵合剂中治疗CHB 的有效成分152 个，潜在作用靶点127个。“赤茵合剂-有效成分-靶点-CHB”网络图分析得知槲皮素、丹参酮IIA、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮、和山柰酚、木犀草素等能连接到较多的靶点，可能是赤茵合剂治疗CHB 的关键有效成分。槲皮素是茵陈、苦参和甘草的共有成分，有研究发现槲皮素可以减少乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）和乙肝e 抗原（hepatitis B virus e antigen，HBeAg）的分泌，降低HBV 基因组DNA 的水平，进一步探究发现槲皮素对HBV 的复制也有抑制作用，具有保护肝脏的作用[11-12]。有研究表明芒柄花黄素可以显著抑制肝癌细胞中COX-2 和cyclin D1 的表达，将细胞阻滞在G0/G1 期，抑制肝癌的发生[13]。山柰酚则可通过下调IL-6 与TNF-α 的水平，减轻肝脏炎症反应损伤[14]。丹参酮IIA 可将细胞阻滞在G0/G1 期，诱导细胞凋亡。研究表明丹参酮IIA 可以抑制多种人类癌症的增殖，包括肝细胞癌[15]。木犀草素可降低HBsAg、HBeAg、HBV DNA 复制中间体水平，以及HBsAg 和乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg） 的表达[16]，能够抑制肝星状细胞HSCs 的迁移，拮抗肝脏纤维化[17]。结果显示，赤茵合剂可能通过抗炎、抑制HBV 复制、抗纤维化等多途径实现治疗CHB 的目标[18]。

通过PPI 网络分析得到TP53、AKT1、PTGS2、TNF、IL6、JUN、STAT3、1L1B 等核心靶点，可能是赤茵合剂治疗CHB 的核心靶点。TP53 能诱导细胞周期阻滞、凋亡和衰老，进而抑制肿瘤的发展[19]。TP53 是人类癌症中最常发生突变的基因之一[20]，当TP53 发生突变时，会导致细胞增殖异常，从而促进癌症发生[21]。AKT1 是人类肿瘤中重要的调节因子，慢病毒介导Akt1 shRNA 载体可抑制肝癌HepG2 细胞增殖和侵袭，并促进其凋亡，进而抑制肝癌的发生发展[22]。PTGS2，又名COX-2，相关研究[23-24]已经证明，COX-2 通过抑制凋亡和诱导增殖促进肝癌细胞系的生长。c-Jun通过细胞自主方式调节肝脏骨桥蛋白（Opn）表达，在HBV 相关肿瘤发生过程中通过促进肝细胞增殖和不典型增生的进展发挥重要作用[25]。STAT3 作为一种转录激活因子，经磷酸化激活后可诱导细胞中癌基因的异常表达，进而促进肿瘤的发生发展[26]。HBV 通过下调miR-340-5p 表达，诱导STAT3 过表达，促进肝癌细胞迁移[27]。IL-1B 是一种促炎细胞因子，通过氧化应激抑制HBV 复制发挥抗病毒作用[28]。TNF-α是参与HBV 感染免疫应答的最重要的细胞因子之一[29]，被认为是HBV 感染的关键因素，可促进免疫介导的病毒学控制[30]，抑制HBV 在肝脏中的表达和复制，从而诱导清除HBV[31]。IL6 是动态免疫调节网络的重要组成部分，可与IL8 共同促进炎症细胞释放炎症介质，参与乙型肝炎的炎症反应，使吞噬细胞吞噬游离的乙肝病毒和乙肝病毒感染的细胞[32]。

KEGG 富集结果显示，显示赤茵合剂的成分可作用于Hepatitis B 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、TNF 信号通路等，这表明赤茵合剂可能通过免疫细胞分化和调控免疫应答参与调控CHB 进程。Hepatitis B 通路是其中一种显著富集的信号通路，通过调控下游的AKt 蛋白，作用于PI3KAkt 通路，进而调控下游的转录因子TP53，再作用于TP53 信号通路的caspase3 蛋白，进而阻断TGFβ 诱导的干细胞凋亡，达到抑制肝癌的进展的目的[33]。Hepatitis B 信号通路通过调控下游的HBx 蛋白，可激活MAPK 细胞信号转导系统，发挥抑制肿瘤抑制蛋白p53 的作用，同时具备抑制细胞凋亡和前凋亡的功能[34]。结果表明，赤茵合剂药物成分可能通过调控乙型肝炎通路中多种蛋白的表达，参与肝细胞增殖、侵袭、转移等过程，从而减缓HBV 病程的进展[35]。绝大多数病毒都会通过调控PI3K-Akt 信号通路，调节病毒在早期感染的活力[36]。研究表明，MAPK 信号通路参与炎症反应、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤侵袭等多种生物学过程[37]。综合分子对接结果分析，丹参酮IIA、槲皮素、木犀草素可能为赤茵合剂治疗CHB 的关键核心成分，PTGS2、JUN、STAT3、1L1B 可能为赤茵合剂治疗CHB 的关键核心靶点。

综上，通过网络药理学方法和分子对接技术，预测出赤茵合剂治疗CHB 的主要有效成分包括丹参酮IIA、槲皮素、木犀草素等，可能通过参与RNA 聚合酶II 启动子转录的正调控、转录的正调控、基因表达的正调控、凋亡过程的负调控、细胞增殖的正调控等发挥治疗CHB 的作用，其机制可能与Hepatitis B、PI3KAkt、MAPK、TNF 等相关炎症信号通路和病毒感染信号通路相关，有助于从新的角度挖掘赤茵合剂治疗CHB 的潜在价值，为后续进一步的生物实验研究与临床应用提供了一定的理论基础。

本研究以网络药理学方法预测的潜在有效成分是由药物有效成分和疾病靶点对比映射后所得，随着有效成分的筛选条件及所研究疾病的改变，可能导致中药复方中公认的有效成分未入选。且中药方剂以中医药理论的配伍为基础，各中药协同发挥治疗作用，机制复杂，并不是将单独的中药材分解成已知化学成分简单的加和，未入选的有效成分作用也不可忽略。研究发现，许多生物利用度低的中药成分在肠道聚集的浓度高于血药浓度，由于肠道菌群的稳态调节，这些中药才能够发挥良好的疗效。对于那些生物利用度低及血药浓度低的中药来说，只以OB 和DL作为筛选，考虑欠全面，且忽视了成分含量对药效影响和成分之间的相互作用。鉴于以上所述网络药理学的局限性，赤茵合剂治疗CHB 的作用机制是否与网络药理学预测的结果一致，将来需要进一步的生物实验来验证预测结果的可靠性和准确性。