金匮肾气丸和桂附地黄丸治疗慢性肾小球肾炎作用机制探讨*

吴双，李家兴，王雯澌，刘艳霞，徐巍巍，刘俊康

陆军军医大学生药学与中药学教研室 重庆 400038

慢性肾小球肾炎（Chronic glomerulonephritis，CGN）大多起源于免疫介导的炎症，以血尿、蛋白尿、水肿及高血压为典型临床表现，并且具有病程长、难以自愈特点，若治疗不当，最终可发展为慢性肾衰竭[1]。现代医学对于慢性肾小球肾炎的治疗，主要采取纠正高血压、调节水电解质平衡、抗血小板凝聚和积极控制感染等策略[2]，但是上述治疗难以取得满意效果。而中医学在慢性肾小球肾炎的治疗中具有巨大的潜力[3]。慢性肾小球肾炎在中医古籍中并无明确病名，根据临床表现可将其将归为“水肿”“腰痛”“肾风”等范畴[4]。张仲景的《金匮要略》曾记载：“虚劳腰痛，少腹拘急，小便不利者，八味肾气丸主之”[5]。 肾主水，肾气亏虚，水液代谢受阻，引发或加重水肿，腰为肾之府，肾气亏虚肾府失荣，不荣则痛[6]。因其出自《金匮要略》，后世也常将文中的八味肾气丸称作金匮肾气丸。而实际上，目前市场上中成药金匮肾气丸并非仲景金匮肾气丸，则是接近添加了牛膝和车前子的济生肾气丸；接近仲景金匮肾气丸的中成药替代品当属桂附地黄丸[7]。

虽然目前传统中医药已经在治疗肾脏慢性疾病上有显著成效，但是仍缺乏一套完整的解释理论和标准规范，能见其效，不见其因，以致很多人存怀疑态度。网络药理学是一种运用现代网络方法分析药物与疾病和靶点之间“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系的药理学方法[8]。本文运用中药网络药理学的方法，利用公开数据信息库挖掘出目前临床上较为常用于治疗肾脏疾病的药物——金匮肾气丸和桂附地黄丸的有效成分、中药靶标、疾病靶标，构建“药物-成分-靶标-疾病”的拓扑网络，预测并比较金匮肾气丸和桂附地黄丸在治疗慢性肾小球肾炎的作用差异，推测其可能存在的分子作用靶点和通路，为后续的实验研究提供理论支持[9]。

资料与方法

1 材料

TCMSP 数据库是获得药物和靶点关系的中草药系统药理学平台；Uniprot 数据库是全球蛋白资源数据库。人类基因数据库Genecard 和人类在线孟德尔遗传平台OMIM 是收集疾病相关的基因的数据库。String 数据库是检索和图像化已知蛋白和预测蛋白之间互作关系的系统。Cytoscape 是可以对网络进行分析的软件。

2 方法

2.1 桂附地黄丸和金匮肾气丸主要成分和靶点的检索和筛选 登录中药系统药理学技术平台TCMSP，根据2020 版《中国药典》中所述，分别以肉桂、泽泻、山茱萸、茯苓，附子、山药、牡丹皮、熟地黄为关键词[10]检索桂附地黄丸中有效成分。将成分通过TCMSP 数据库的药物口服利用度（OB）和类药性（DL）等参数作为筛选条件。其中OB 是衡量药物口服后，经胃肠道被吸收进入循环系统的指标，DL 是衡量药物临床疗效的指标。在对中药进行研究的过程中将OB ≥30%和DL ≥0.18 作为筛选标准[11]。使用同样的方法，根据采用《中药成方制剂》中所述，对今方金匮肾气丸的主要成分（桂枝、山药、附子、山茱萸、熟地黄、茯苓、泽泻、牡丹皮、牛膝、车前子）[12]进行查询并筛选。并利用已发表的文献报道补充与活性化合物相关的已知靶点。然后，将收集到的活性成分所对应的靶点蛋白导入到Uniprot 数据库，设定“Homo sapiens”（人属）为关键词，实现蛋白到基因名称的转化。

2.2 慢性肾小球肾炎相关靶点的查询和匹配 在Genecards 数据库和OMIM 数据库以“慢性肾小球肾炎”的相关英文名称“chronic glomerulonephritis”“chronic nephritis” “CGN”“CKD”等为关键词检索相关靶点蛋白，去除重复部分。将桂附地黄丸有效靶点与慢性肾小球肾炎相关靶点的关系进行分别对应，对比筛选出药物和疾病共同的潜在靶点基因，并利用R语言及程序包VennDiagram 展示韦恩图。并利用同样方法绘制出金匮肾气丸中靶点基因和疾病基因的交集。

2.3 Cytoscape 网络的绘制 将上述查询整理的药物及有效成分和作用靶点导入到Cytoscape 软件进行处理使之可视化，构建出药物-有效成分-靶点基因网络。每一个节点与其他节点的直接作用数量由自由度来表示，即自由度与生物学功能和重要性呈正相关[13]。

2.4 构建PPI 网络 将上述筛选出的交集靶点蛋白导入到String 数据库，以最低相互作用阈值等于0.4和“Human Sapiens”为蛋白质种类筛选交集基因，去除没有相关性的靶蛋白，建立PPI 网络，用以描述桂附地黄丸有效成分与慢性肾小球肾炎靶点。同理构建出金匮肾气丸的PPI 网络，并统计两者的前15 节点数目排名。

2.5 KEGG 信号通路富集和GO 功能分析 使用KEGG 数据库对重要靶点基因进行富集分析，筛选出信号通路满足P，Q ≤0.05，并运用R 语言包进行显示。再利用R 语言中的BiocManager 包和enrichGO 包对慢性肾小球肾炎潜在靶点分别和桂附与金匮的有效成分进行GO 分析，并以气泡图进行描述。

结 果

1 筛选的活性成分和预测的靶标

以上文对OB 和DL 值的限定，在TCMSP 数据库对桂附地黄丸和金匮肾气丸进行检索，去重后得到核心活性成分，如图1（a）（b）所示。

图1 （a） 桂附地黄丸成分数据

图1 （b） 金匮肾气丸成分数据

2 药物-疾病共同靶标结果

桂附地黄丸和金匮肾气丸的韦恩图如图2（a）（b）所示。其中慢性肾小球肾炎的靶标基因为1849 个，桂附地黄丸和金匮肾气丸的靶标基因分别为137 个和230 个，取交集后，治疗靶点为58 和111 个。

图2 （a）

图2 （b）

3 药物-有效成分-靶点-疾病网络图绘制结果

如图3（a）（b）所示。每一个节点用不同颜色表示，红色，绿色和蓝色节点分别代表药物，活性成分和作用靶点。点与点之间的连线代表了两者之间的对应关系。图3（a）为桂附地黄丸的药物-有效成分-靶点-疾病相互作用网络，包括7 个发挥作用的药材，47 种药材中的活性成分，137 个药物作用靶点和1 种相关疾病，共计192 个节点和500 条连线。图3（b）为金匮肾气丸的药物-靶点-疾病相互作用网络，包括10 个发挥作用的药材，81 种药材中的活性成分，232 个药物作用靶点和1 种相关疾病，共计324 个节点和895 条连线。

图3 （a）

图3 （b）

4 共同靶点的蛋白质-PPI 网络构建分析

根据STRING 网站对筛选出来的治疗慢性肾小球肾炎靶点蛋白进行分析得到的PPI 网络图见图4（a）（b）。如图4（a）所示桂附地黄丸57 种共同靶蛋白之间的相互作用关系，如图4（b）所示金匮肾气丸相互作用的110 个靶蛋白，节点和边分别代表了靶蛋白和蛋白的互相关系，包括有既往实验证明、基因共表达、基因共现、蛋白质同源、基因邻接、基因融合等，桂附地黄丸和金匮肾气丸的前15 节点数目排名见于图5（a）（b）。

图4 （a）

图4 （b）

图5 （a） 桂附地黄丸靶蛋白节点数目排名（示前15）

图5 （b） 金匮肾气丸靶蛋白节点数目排名（示前15）

5 共同靶点的KEGG 通路富集分析和GO 功能富集

根据KEGG 分析结果桂附地黄丸和金匮肾气丸抗慢性肾小球肾炎预测靶点的通路分布，结果发现分别有150 条和167 条KEGG 代谢通路参与其中，图6（a）（b）列举了排在前面的15 条通路。以动脉粥样硬化与脂质相关的信号通路为例，示桂附肾气丸和金匮地黄丸主要作用靶点的具体机制见图7（a）（b）。

图6 （a） 金匮肾气丸KEGG 信号通路分析

图6 （a） 桂附地黄丸KEGG 信号通路分析

图7 （a）

图7 （b）

图8（a）（b）展示GO 分析气泡图。生物过程由纵坐标表示，基因数量由横坐标和气泡的面积大小共同决定。P 值越小，气泡红色越深。

图8 （a）

图8 （a）

讨 论

通过药物-靶点-疾病网络可发现，桂附地黄丸的网络中，自由度较高的活性成分是kaempferol、beta-sitosterol、Stigmasterol、Tetrahydroalstonine、Kadsurenone，提示这些成分可能是桂附地黄丸治疗慢性肾小球肾炎的物质基础；自由度较高的靶点是NCOA2、PTGS2、PTGS1、PGR、NR3C2、HSP90、ADRA1B，提示这些靶点可能是桂附地黄丸治疗慢性肾小球肾炎的关键靶点。而在金匮肾气丸的网络中，作用靶点较多的活性成分是kaempferol、beta-sitosterol、Stigmasterol、Tetrahydroalstonine、Kadsurenone，连接活性成分和通路较多的靶点是NCOA2、PTGS2、PTGS1、PGR、HSP90、NR3C2、ADRA1B。通过对比两个网络图，可以初步发现金匮肾气丸和桂附地黄丸在主要作用的活性成分和潜在靶点上效果基本类似。

通过PPI 网络中可见，在桂附地黄丸在治疗慢性肾小球肾炎中，可能是作用于TNF、AKT1、VEGFA、PPARG、CASP3、PTGS2、JUN 等核心靶点发挥作用。而在金匮肾气丸治疗慢性肾小球肾炎中，可能是作用于TNF、ATK1、IL-6、VEGFA、IL1-β、JUN、CASP3等核心靶点发挥作用。其中两者都包括的相互作用较为密切的蛋白有TNF、AKT1、VEGFA、PPARG 和CASP3 等。其中，TNF 可以促进细胞凋亡，在自身免疫疾病和炎症中发挥重要作用[14]，通过调控TNF-α可以保护肾脏[15]；VEGFA 可以抑制细胞凋亡，参与血管通透性调节[16]；PPARG 在参与激活某种受体，进而促进过氧化物酶体增殖中发挥重要作用[17]；CASP3 参与负责凋亡执行的半胱天冬酶的激活级联[18]。两者药物的靶点都主要涉及炎症物质产生，细胞生长与凋亡，脂质代谢，下游基因转录等方面，由此我们可以推测两种药方可能通过抑制细胞凋亡，降低炎症反应，改善肾血管通透性等方面来减轻肾脏损伤。

在GO 富集和KEGG 通路富集中，两者排名较前且有分子作用价值的通路都有脂质和动脉粥样硬化信号通路、AGE-RAGE、乙肝、化学致癌受体激活、PI3K/Akt、EB 病毒感染、人乳头瘤病毒感染、HIF-1、TNF 等信号通路。通过介导AGE-RAGE、TNF、PI3K/AKT、HIF-1 等这些信号通路，桂附地黄丸和金匮肾气丸参与了机体脂质和糖类代谢、氧化应激反应、营养水平、抗细菌病毒、抗细胞凋亡等生物学过程以发挥其治疗效果。综合两者的蛋白互作（PPI）网络和KEGG 通路富集分析中可见，慢性肾小球肾炎的发生存在众多的核心靶基因，其中与TNF、AKT1、VEGFA、CASP3、JUN 等关系最为密切，其发病信号通路主要包括AGE-RAGE、TNF、PI3K/Akt、HIF-1 通路等。对比金匮肾气丸的网络药理学分析，我们不难发现不论是金匮肾气丸，还是桂附地黄丸，在调节血脂异常，抑制动脉粥样硬化的斑块形成、抑制细胞异常凋亡、调节肾脏对尿糖的过滤和重吸收，防止肾性糖尿病的发生、防止抗原免疫复合物在肾小球的沉积发挥了相同的作用。

但是，仔细对比两者KEGG 通路可以发现，一方面金匮肾气丸作用的靶蛋白和通路较桂附地黄丸更多，这一方面是由于金匮肾气丸比桂附地黄丸多了牛膝和车前子两味药，因此拥有更多的活性成分。另一方面，金匮肾气丸将古方中的肉桂替换成桂枝，有文章表明在桂枝皮部的有效成分更高，且直径与皮部含量成负相关[19]。这也就不难理解，为什么桂枝相较于肉桂的活性成分会有明显的增加。另一方面作为同样的靶点，金匮肾气丸作用的更集中于通路下游，以图7（a）（b）脂质和动脉粥样硬化信号通路为例。金匮肾气丸和桂附地黄丸均可通过调节内皮细胞上的基质金属蛋白酶1（MMP1），调控下游PI3K-AKT途径，进而抑制eNOS、Bax 的产生，减少细胞凋亡，同时可以通过下调JNK-AP-1 途径抑制炎症因子的产生以及单核巨噬细胞的粘附和趋化，减少粥样斑块的破裂，改善血管硬化。但在对比桂附地黄丸和金匮肾气丸通路图时，我们发现金匮肾气丸更多作用于通路下游的单核细胞粘附趋化因子，炎症因子等，直接调控这些趋化因子发挥作用。除此外，金匮肾气丸还可以调控apoB 和apoB100，调控低密度脂蛋白运输，进而改善脂质血管沉积。

综上所述，有多种核心靶基因及其相关的信号通路牵涉到了慢性肾小球肾炎的发病机制中[20]。我们通过网络药理学比较了金匮肾气丸和桂附地黄丸在治疗慢性肾小球肾炎的活性成分和信号通路，一分子对应多靶点，且一靶点对应多通路[21]，揭示了两种中成药在抗慢性肾小球肾炎这一自身免疫性疾病过程中多成分、多靶点、多通路的作用特点，并比较两种药在治疗过程中的相同和不同之处，为后续课题组在抗慢性肾小球肾炎实验设计优化和具体机制阐述提供了数据参考。但受限于当前中药的数据库仍存在数据资源不足的问题，使得所探究的中药化学成分及靶点可能与实际存在出入，因此关于金匮肾气丸在慢性肾小球肾炎治疗方面是否较桂附地黄丸有更好的效果，仍需要依靠文献报道，实验验证等方式进一步证实金匮肾气丸和桂附地黄丸治疗慢性肾小球肾炎的作用机制差异。同时在KEGG 通路富集分析中，二者除了在治疗慢性肾小球肾炎外，还在肝炎、化学物质致癌、EB 病毒感染、卡波氏肉瘤等通路发挥作用，可以考虑通过寻找二者共同作用的免疫学相关的靶点和相关机制来加以具体解释，为后续相关疾病的治疗提供理论支持。