马齿苋多糖对反流性食管炎大鼠的作用及相关机制实验研究

陈昶洲,李 莉,张 雯,凌江红

(上海中医药大学附属曙光医院消化科,上海 200021)

反流性食管炎指胃内容物和胃酸倒流进食管引起的食管炎症反应,患者临床多表现为反酸、烧心和胸痛等,病情严重者可出现食管出血和溃疡的并发症,并对患者的健康造成威胁[1]。调查[2]显示,美国反流性食管炎发病率最高,约20%成年人合并反流性食管炎,欧洲发病率约10%。国内报道[3]显示,反流性食管炎的发病率约5%～10%。反流性食管炎的治疗主要分为减轻体重、体位调整和饮食习惯的非药物治疗及H2受体拮抗剂和质子泵抑制剂的药物治疗。既往治疗方案虽可一定程度上减轻患者病情,但效果仍未达到预期。反流性食管炎的具体发病机制仍未被完全阐明,但炎症反应被证实贯穿疾病发生、发展的全过程[4]。核因子(Nuclear factor,NF)-κB(NF-κB)/白细胞介素(Interleukin,IL)-6信号通路是参与激活机体炎症反应的核心靶点,被证实在反流性食管炎炎症的激活中扮演着尤为重要的角色[5]。马齿苋多糖是马齿苋的有效活性成分,具有抗菌抗炎、调节免疫和抗氧化等多种药理活性[6]。然而,现阶段马齿苋多糖是否能通过调节食管炎症促进反流性食管炎病情转归鲜有报道,尤其是其作用机制亟待明确。基于此背景,本研究拟通过构建反流性食管炎大鼠模型,以期阐明马齿苋多糖对大鼠食管炎症的治疗价值并深入阐明其作用机制,旨在为后续临床综合治疗方案的构建提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取40只体重220 g左右的SD大鼠为研究对象。所有大鼠购置后均在我中心实验室进行1周的适应性喂养。

1.2 主要试剂 马齿苋药材购自上海源叶生物科技有限公司;酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海初态生物科技有限公司;TRIzol购自上海尚宝生物科技有限公司;SYBRR Green荧光染料试剂盒购自上海惠诚生物科技有限公司。

1.3 马齿苋多糖制备 取干燥马齿苋药材600 g,采用清水进行清洗,文火进行水煎。取3次过滤药液浓缩至600 ml,并采用无水乙醇将药液浓度调整至75%,静置24 h后进行洗涤处理,最终得到白色多糖粉末。待需要使用时制备成对应浓度。

1.4 大鼠分组与处理 将所有大鼠随机分为对照组、模型组、马齿苋多糖低剂量组、马齿苋多糖中剂量组和马齿苋多糖高剂量组,每组8只。除对照组外,其他组构建模型。马齿苋多糖低、中、高剂量组分别给予7.5、15、30 g/kg马齿苋多糖灌胃,对照组和模型组给予等剂量0.9%氯化钠溶液灌胃,连续10 d。

1.5 反流性食管炎大鼠模型制备 所有需要进行模型制备的大鼠均采用夹尾刺激法+导尿管球囊扩张法建立反流性食管炎动物模型。采用止血钳夹住大鼠尾巴将大鼠激怒,每次40 min,并间隔20 min更换夹尾的地方,所有大鼠均连续刺激7 d,每天进行刺激1次。最后1 d夹尾刺激完成后对大鼠腹腔注射10%戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行麻醉后逐层分离大鼠腹腔皮肤及肌肉组织,暴露并游离食管下段及贲门处,暴露食管后将两条完全消毒的橡皮筋放置在食管后方,向导尿管气囊内注入5 ml气体后将气囊向外拉,拉出操作在感受到阻碍且无法再拉出时停止。随后将气囊内的气体吸出,并将气囊向食管内拉,使气囊位置处于食管下括约肌(LES)处。再次进行气体注射,待LES充分扩张后将事先放置的橡皮筋牵拉以固定球囊并维持5 min,最终使食管下括约肌松弛,则视为建模成功。

1.6 ELISA法检测相关炎症因子和胃肠激素表达水平 取大鼠食管组织并采集血样,3500 r/min条件下低速离心10 min,静置20 min后分离上清,并置入-80 ℃冰箱待测。采用ELISA法检测炎症因子[肿瘤坏因子(TNF)-α、IL-1β和IL-8]及胃肠激素[血管活性肠肽(VIP)、胃肠饥饿激素(Ghrelin)、胃泌素(GAS)]表达水平。

1.7 Western blot检测NF-κB/IL-6信号通路蛋白表达水平 取食管组织进行研磨、匀浆以提取组织中总蛋白,并采用BCA法检测相应蛋白浓度。向样品中加入缓冲液并对其进行加热,待加热至沸腾后制作凝胶。随后采用电转移法将蛋白转移至PVDF,并陆续加入一抗和二抗进行孵育。孵育完成后采用Bio-Rad Quantity 4.5.2软件测定吸光度(A)并计算NF-κB和IL-6蛋白相对表达水平。

1.8 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测相关基因表达水平 取大鼠食管组织,采用TRIzol法提取总RNA,并采用SYBRR Green荧光染料试剂盒和ABI Step One PCR仪进行反转录操作。反转录条件:98 ℃、50 ℃和37 ℃条件下进行反转录操作,待反转录为cDNA后进行qRT-PCR扩增,并以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参。反应条件:65 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,95 ℃ 10 min,共40个循环。最后参考2-ΔΔCt计算原癌基因c-myb、增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki-67 mRNA相对表达水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠炎症因子水平比较 见表1。与对照组比较,模型组和马齿苋多糖不同剂量组TNF-α、IL-8、IL-1β表达水平明显更高,且马齿苋多糖高剂量组显著低于模型组、马齿苋多糖低剂量组和中剂量组(均P<0.05)。

表1 各组大鼠炎症因子水平比较(μg/L)

2.2 各组大鼠NF-κB、IL-6蛋白相对表达水平比较 见表2。与对照组比较,模型组和马齿苋多糖不同剂量组NF-κB、IL-6蛋白表达水平明显更高,且马齿苋多糖高剂量组显著低于模型组、马齿苋多糖低剂量组和中剂量组(均P<0.05)。

表2 各组大鼠NF-κB、IL-6蛋白相对表达水平比较

2.3 各组大鼠VIP、Ghrelin、GAS表达水平比较 见表3。与对照组比较,模型组和马齿苋多糖不同剂量组Ghrelin、GAS表达水平明显更低,VIP明显更高;马齿苋多糖高剂量组Ghrelin、GAS表达水平显著高于模型组、马齿苋多糖低剂量组和中剂量组,VIP显著低于模型组、马齿苋多糖低剂量组和中剂量组(均P<0.05)。

表3 各组大鼠VIP、Ghrelin、GAS表达水平比较(μg/L)

2.4 各组大鼠c-myb、PCNA、Ki-67 mRNA相对表达水平比较 见表4。与对照组比较,模型组和马齿苋多糖不同剂量组c-myb、PCNA、Ki-67 mRNA表达水平明显更高,且马齿苋多糖高剂量组显著低于模型组、马齿苋多糖低剂量组和中剂量组(均P<0.05)。

表4 各组大鼠c-myb、PCNA、Ki-67 mRNA相对表达水平比较

3 讨 论

饮食结构的转变致使反流性食管炎的发病率逐年升高,胃酸和胆汁经食管向呼吸道和口腔中反流时可对沿途的呼吸道和口腔造成损伤[7]。为进一步提高临床治疗反流性食管炎的临床效果,进一步明确疾病的发生机制并寻找干预靶点尤为重要。本研究参考王强等[8]的方法制备了反流性食管炎大鼠模型,结果发现,模型组大鼠食管炎症被显著激活,且VIP、Ghrelin和GAS参与胃肠兴奋的激素存在严重的表达紊乱,提示靶向调节反流性食管炎大鼠的胃排空和抑制炎症是治疗的潜在靶点。

抑制炎症反应水平一直是反流性食管炎患者治疗的重要靶点。TNF-α是重要的促炎因子,其表达上调后可加重食管黏膜损伤,从而使反流性食管炎患者病情发生恶性进展[9]。IL-8是机体中重要的趋化因子,高表达的IL-8可促使炎症细胞向病灶部位集聚,从而导致病灶处形成炎症级联反应并加重病情进展。有研究[10]证实,IL-8在食管炎患者表达上调且与炎症反应的过度激活密切相关。IL-1β是重要的炎症介质,被证实在反流性食管炎中表达上调。研究[11]发现,胃酸反流后可对食管造成损失并激活炎症,在炎症反应激活的过程中IL-1β的表达被激活,高表达的IL-1β可继发引起食管平滑肌收缩并导致病情加重,同时还可促进炎症细胞的活化和浸润进一步导致食管处炎症反应升高,从而使病情进一步加重。本研究结果显示,反流性食管炎大鼠采用马齿苋多糖进行干预可有效抑制TNF-α、IL-8、IL-1β的表达,且采用大剂量进行干预可有效提高对炎症因子的抑制作用,表明马齿苋多糖可有效抑制反流性食管炎大鼠食管部位的炎症反应。Rahimi等[12]研究证实,马齿苋的有效成分具有抗炎效果。Noorbakhshnia等[13]研究表明,马齿苋可通过靶向抑制TNF-α的表达减轻炎症反应。

NF-κB/IL-6信号通路是调控机体炎症因子表达的重要信号通路。NF-κB是一种转录因子,可调控炎症相关因子的表达,其中IL-6是其重要的下游因子,亦是促进机体炎症反应的关键信号因子。本研究结果显示,反流性食管炎大鼠食管组织NF-κB、IL-6的蛋白表达水平明显升高,采用马齿苋多糖治疗后NF-κB/IL-6信号通路相关蛋白的表达明显被抑制,且大剂量治疗对其抑制作用更加显著。这预示着马齿苋多糖靶向调节食管组织的炎症水平可能与抑制NF-κB/IL-6信号通路的激活有关。Miao等[14]研究证实,马齿苋可通过抑制NF-κB相关的炎症信号表达发挥抗炎作用。Jia等[15]研究证实,马齿苋多糖可通过靶向调节Toll样受体(TLR)4/髓分化因子88(MyD88)/NF-κB信号通路抑制下游炎症因子的表达。

VIP是一种神经肽,主要分布在肠道和胃,参与调控胃肠道的收缩,从而促进胃排空[16]。Ghrelin是一种胃肠道激素,主要参与能量代谢和胃排空的调节。GAS是一种胃肠道激素可通过激活其受体的表达从而抑制胃酸分泌和促进胃排空[17]。本研究结果显示,马齿苋多糖有助于调节VIP、Ghrelin、GAS的表达,从而增加大鼠的胃排空,这表明马齿苋多糖不仅有利于反流性食管炎大鼠食管炎症的抑制,还有利于促进胃排空,从而从疾病发生的机制上缓解病情。

反流性食管癌和食管腺癌是一个连续发展的过程,起初的食管炎症可因上皮损伤和黏膜破坏并进行性发展而出现不典型增生并最终演变为腺癌。c-myb是一类原癌基因主要定位在消化道上皮和神经系统中,可参与调节多种促增殖基因和抗凋亡基因的调控,从而促进多种恶性肿瘤的发生与发展[18]。PCNA和Ki-67是目前已知受c-myb调节的促增殖基因,可作为客观反映细胞增殖能力的标志分子[19]。本研究结果显示,马齿苋多糖可有效抑制c-myb、PCNA和Ki-67的表达,提示马齿苋多糖还可抑制食管上皮过度增生,从而降低癌变风险。Zhao等[20]研究表明,马齿苋多糖可通过影响细胞周期、调节细胞凋亡等机制发挥抗肿瘤活性。然而,马齿苋多糖是否有助于进一步应用于食管腺癌的预防仍需进一步实验论证。

综上所述,反流性食管炎大鼠采用马齿苋多糖进行干预可有效抑制食管组织炎症,其机制与抑制NF-κB/IL-6信号通路有关。此外,马齿苋多糖可调节胃肠激素表达以促进胃排空,同时还可抑制促增殖基因表达而降低食管恶性病变的发生风险。