食品中沙门氏菌测定能力验证和关键控制点分析

宋 洋

（宁德市食品药品检验检测中心，福建宁德 352100）

0 引言

沙门氏菌（Salmonella） 是一种常见的、容易造成食源性疾病的细菌[1]。1885 年美国细菌学家D. E.Salmon 首次从猪肠道中分离出这种细菌而得名，目前发现的沙门氏菌属有肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌2 种，大约有2 600 种血清型[2-3]。人食用沙门氏菌污染的食物，可能导致食物中毒，大多数表现为患上腹泻等胃肠道疾病[4]。

为了防止沙门氏菌污染的食品流入市场，保障食品安全，我国禁止在散装即食食品和预包装食品中检出沙门氏菌[5-6]，并制定《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》 （GB 4789.4—2016）[7]。机构或企业对沙门氏菌的检测需求也不断加强，为了不断保障和提高沙门氏菌的检测能力，可以选择参加能力验证。能力验证是指利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力，实验室间比对是按照预先规定的条件，由2 个或多个实验室对相同或类似的物品进行测量或检测的组织、实施和评价[8]。参加能力验证，能提高或确保检测方法的有效性，符合国际质量标准的要求[9]。该实验室希望通过参加“食品微生物（沙门氏菌） 的测定”能力验证，并通过分析检测过程，提升对沙门氏菌的检测能力。

1 材料和方法

1.1 样品

实验室参加华测检测认证集团股份有限公司开展的“CTI-0422110131 食品微生物（沙门氏菌） 的测定”能力验证计划后，收到该公司寄出的2 瓶真空西林瓶装样品。

1.2 培养基和试剂

缓冲蛋白胨水（BPW，批号：191023）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC，批号：201222）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB，批号：210223）、HE 琼脂（HE，批号：210607）、亚硫酸铋琼脂培养基（BS，批号：210125）、沙门氏菌显色培养基（批号：210603）、0.1%煌绿溶液（批号：211214）、碘液（批号：220104） 等，北京陆桥技术股份有限公司提供；沙门氏菌生化鉴定盒（批号：5110419），广东环凯生物科技有限公司提供；木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（XLD，批号：1090311），广东环凯微生物科技有限公司提供；氯化钠（NaCl，批号：20220514），国药集团化学试剂有限公司提供。

1.3 仪器设备

HFsafe-1200 型生物安全柜，上海力申科学仪器有限公司产品；MLS-3751L-PC 型高压蒸汽灭菌器，日本三洋电子科技有限公司产品；GNP-9270 型隔水氏恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司产品；YP3002 型电子天平，余姚金诺天平仪器有限公司产品；HYCD-290 型医用冷藏冷冻冰箱，青岛海尔特种电器有限公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 试验前期准备

（1） 样品信息登记。将收到的样品进行完整度检查并登记样品信息，CTI-0422110131 食品微生物（沙门氏菌） 的测定能力验证样品2 瓶，瓶身标识分别为No.006 和No.107。将样品置于-20 ℃保存，阅读能力验证计划作业指导书后开始试验。

（2） 培养基配制和灭菌。分别按照培养基和试剂瓶身标识说明，配制225 mL BPW 培养基2 份，100 mL TTB 培养基1 份，10 mL SC 培养基2 份，150 mL BS 培养基1 份，150 mL XLD 培养基1 份，150 mL HE 培养基1 份，150 mL 沙门氏菌显色培养基。将上述培养基，按照121 ℃，15 min 条件进行蒸汽灭菌，在生物安全柜内将对应量碘液和0.1%煌绿溶液加入TTB 后进行分装，每10 mL 装入1 支试管。BS、XLD、HE、沙门氏菌显色培养基按每个平皿约20 mL 进行倒平板。

（3） 无菌生理盐水溶液。称取1.35 g 氯化钠（NaC）l 放入250 mL 锥形瓶中，加入150 mL 纯化水，制成质量分数为0.9%的NaCl 溶液，按照121 ℃，15 min 条件进行蒸汽灭菌后制得。

（4） 无菌瓶。准备2 个250 mL 空的锥形瓶，按照121 ℃，15 min 条件进行蒸汽灭菌备用。

1.4.2 样品处理

在生物安全柜内进行试验。从冰箱取出的样品No.006，回温至室温后，小心开启西林瓶。按作业指导书要求，用60 mL 无菌生理盐水对样品进行再水化，先加4 mL，待样品溶解后吸入无菌瓶中，用剩余56 mL 反复清洗西林瓶内壁，回收清洗液至无菌瓶，作为待测样品原液，试验编号6。另一个样品No.107 按上述步骤同样操作，试验编号107。

1.4.3 预增菌和增菌

按照GB 4789.4—2016 方法开始检验，无菌操作取25 mL 6 号样品原液倒入装有225 mL BPW 的瓶中，摇匀后，放入36.0 ℃的恒温培养箱培养14 h，轻摇后，移取1 mL 到TTB 内，于42.0 ℃的恒温培养箱培养24 h，同时移取1 mL 到SC 内，于36.0 ℃的恒温培养箱培养24 h。107 号样品操作步骤相同。

1.4.4 分离

分别用接种环取SC 1 环，划线接种于BS 平板、XLD 平板、HE 平板、沙门氏菌显色平板各1 个，于36.0 ℃分别培养48 h（BS 平板） 或24 h（XLD 平板、HE 平板、沙门氏菌显色平板），观察菌落形态，与GB 4789.4—2016 中所述沙门氏菌属菌落特征进行比较，鉴别是否有符合的典型菌落，对TTB 重复上述步骤，得到表1 和图1。

图1 增菌液中分离到的菌株在平板上的菌落形态直观图

表1 增菌液中分离到的菌株在平板上的菌落形态和鉴别

增菌液中分离到的菌株在平板上的菌落形态和鉴别见表1，增菌液中分离到的菌株在平板上的菌落形态直观图见图1。

1.4.5 生化试验

按照沙门氏菌生化鉴定盒使用说明书，挑取6号样品经SC 增菌后分离到的菌株在BS 平板、XLD平板、沙门氏菌显色平板上典型菌落各1 个，编为6-1，6-2，6-3。进行三糖铁琼脂和营养琼脂培养，同时进行赖氨酸脱羧酶试验，待试验出结果后，根据说明书判断可能的菌属和种。从营养琼脂平板上挑取可疑沙门氏菌属菌落，按说明书要求进行沙门氏菌属生化试验：蛋白胨水（供靛基质试验）、尿素琼脂（PH7.2）、氰化钾试验，观察现象。挑取107号样品经SC 和TTB 增菌后分离到的菌株在XLD 平板、HE 平板上疑似沙门氏菌特征菌落的淡红色中心且边缘呈白色菌落、墨绿色菌落和黄褐色菌落各1 个，编号107-1，107-2，107-3。重复6 号样品操作步骤。

1.5 结果上报和反馈

按能力验证作业指导书要求，上传试验结果和相关记录。根据能力验证反馈结果进行分析。

2 结果和分析

6 号和107 号样品经过增菌后在选择性平板上的菌落，按照沙门氏菌生化鉴定盒说明书步骤开展生化试验，说明107 号样品未检出沙门氏菌。挑取6 号样品可疑沙门氏菌属菌落进行沙门氏菌属生化反应鉴别，说明6 号样品中检出沙门氏菌。

三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验结果和鉴别见表2，沙门氏菌属生化反应鉴别见表3。

表2 三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验结果和鉴别

表3 沙门氏菌属生化反应鉴别

按作业指导书要求填写2 个样品中沙门氏菌的定性结果：No.006 为阳性，No.107 为阴性，并上传试验原始记录。华测检测认证集团股份有限公司对能力验证结果反馈为“满意”，说明该实验室顺利通过此次能力验证。

3 关键控制点分析

3.1 样品接收和实验前期准备

能力验证组织方在寄出能力验证样品时会告知参与单位，参与单位在收到待测样品后，要严格检查待测样品的完整度，确认无破损。如果收到待测样品和寄出样品时间间隔超过7 d、装有待测样品容器破损、待测样品碎成粉末，建议和寄出样品人员方沟通，重新寄出一份样品，避免因为运输原因导致待测样品中微生物损耗或者染菌，降低通过率。收到样品，详细登记样品信息后，若未立即开始试验，应将样品放入适宜贮存的环境中。准备开展或用于能力验证的环境、仪器、培养基、试剂都应是经过检定或检测符合实验需求的。试验所用培养基和试剂应现配。试验前要熟悉能力验证作业指导书、GB 4789.4—2016 检验方法、生化鉴定试剂盒或生化鉴定仪器的说明书等内容。

3.2 试验过程

BPW 用于预增菌，作用是修复受损伤的沙门氏菌，GB 4789.4—2016 中对BPW 培养时间规定为8~18 h，跨度较大，并且桂国弘等人[10]发现经过BPW 增菌12 h 处理后的冷鲜鸡微生物，沙门氏菌的检出率最高，所以试验中对BPW 预增菌的时间要注意把握。GB 4789.4—2016 规定要同时用TTB 和SC进行增菌，是因为于沙门氏菌属血清型较多，TTB和BS 增菌有互补效果，所以试验中不能仅用其中1种进行增菌。GB 4789.4—2016 中要求选用的2 种选择平板中至少1 种是BS 平板，可能是由于BS 平板选择性较好。试验过程中接种分离也比较重要，能力验证中6 号样品在部分选择性平板中无菌落生长，可能是由于接种环蘸取的增菌液比较少或者增菌液未摇匀。生化试验按GB 4789.4—2016 要求，可以选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，试验用的生化鉴定试剂盒，已经过验收，符合试验需求。由于本次能力验证是定性试验，所以也未进行沙门氏菌属血清学鉴定、血清学分型试验。有条件的实验室可以利用如PCR 技术、LMAP 技术、生物传感器技术、基因芯片、基因测序、MALDI 飞行时间质谱分析、快速检测卡等检测技术方法对样品进行检测，将结果与国标法检测结果进行对比，确保能力验证通过[11-13]。

3.3 结果处理

要按要求在规定时间内上报实验结果，并上传原始记录。结果表示要符合要求，如本次试验要求上报的定性结果用“阳性”或“阴性”表示，就不能用“+”“-”或“检出”“未检出”代替。

能力验证出现结果错误的可能原因和处理方法见表4。

表4 能力验证出现结果错误的可能原因和处理方法

4 结论

食品安全备受瞩目，加强食品中致病菌的检测重要性日益凸显，提高检测机构食品中致病菌检测能力刻不容缓。实验室参与沙门氏菌能力验证作为机构检验检测能力的一种方法[14]，是一种重要的外部质量保证手段，不仅考核实验操作者的能力，也是对实验室致病微生物检测综合能力的考核。通过参与能力验证，可以发现试验中包括实验操作、仪器设备、数据和结果处理等存在的问题，以及与同行间的差异，对实验室的相关技术水平有一个直观的认识。但是，必须要注意的是单次能力验证的结果只代表某一个时刻或某段时间实验室对该项目的检测能力，并不一定能完全体现实验室的真实检测能力[15]。定期开展沙门氏菌能力验证并分析能力验证中关键控制点，有助于提高实验室人员的检验能力，提升机构的检测水平，强化对食品安全的保障能力。