伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅在繁殖性能、血清激素水平和基因表达量的比较

唐碧徽,张俐华,李海英,张 冲,蒋廷浩,赵晓钰,蒋 腾,丁雅文,吴盈萍,赵全庄

(1.新疆农业大学动物科学学院,乌鲁木齐 830052;2.新疆额敏县国家级飞鹅保种场,新疆额敏 834606)

0 引 言

【研究意义】伊犁鹅是新疆特有的优良地方禽种,耐粗放饲养,肉质优良,但产蛋性能较低,且就巢性强,成年母鹅年均产蛋仅为6～15枚[1]。霍尔多巴吉鹅繁殖能力优于伊犁鹅,且无就巢性,成年母鹅平均年产蛋为30～50枚[2]。霍尔多巴吉鹅在生产中可作为杂交亲本对于提高杂交后代的生产性能具有显著的杂交优势[3]。有效提高伊犁鹅的繁殖性能,对伊犁鹅的产业化发展具有重要意义。【前人研究进展】鹅的生产和繁殖特性在很大程度上取决于遗传因素,其在品种之间的遗传差异较为明显[4]。研究发现[5],鹅的基因型和品种对鹅的重要经济性状有影响,如体重、饲料利用率、产蛋量、繁殖能力以及对饲养条件的适应性等。在鹅的生产中,经常通过品种间杂交的方法充分利用各品种间的杂交优势提高生产性能。目前在已报道的文献中,伊犁鹅只与豁眼鹅进行过杂交[6],左瑞华等[7]以皖西白鹅为父本与霍尔多巴吉鹅进行杂交试验发现,杂交后代的平均产蛋量和种蛋的受精率显著高于纯种皖西白鹅(P<0.05)。黄炎坤等[8]以浙东白鹅公鹅作为父本与霍尔多巴吉鹅进行杂交试验,发现杂交后代的生产性能优于纯种浙东白鹅。霍尔多巴吉鹅在作为杂交亲本时的优势表现较明显。【研究切入点】伊犁鹅与霍尔多巴吉鹅在产蛋数量上存在较大差异,且有关于鹅种间繁殖性能比较研究的报道较少。基于霍尔多巴吉鹅在杂交改良方面的优势,结合伊犁鹅现阶段需要得到繁殖性能的改良,亟需研究伊犁鹅与霍尔多巴吉鹅在繁殖性能方面的差异。【拟解决的关键问题】比较伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅在相同饲养管理条件下的繁殖性能、生殖激素浓度和BMP2、BMP6、MIS、ENO1和EP300基因表达水平的差异,为霍尔多巴吉鹅改良伊犁鹅繁殖性能的可能性提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验鹅

试验选取健康状况良好、饲养条件一致、处于产蛋期的2岁伊犁鹅母鹅和霍尔多巴吉鹅母鹅为研究对象,其中伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅各120只(公母比例为1∶4,公鹅24只,母鹅96只),以两个品种为单位分组,每个品种的鹅群体分为24个重复,试验周期为2022年3月～6月,试验动物均由新疆额敏县国家级新疆飞鹅保种场提供。

1.1.2 饲养管理

试验在新疆额敏县国家级新疆飞鹅保种场进行,对伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅进行分群,采用平地圈养的饲养方式,鹅舍内设有料槽、产蛋窝、运动场和水池。在试验期间饲喂产蛋期全价饲粮,饲粮营养水平参考美国NRC(1994)[9],试验期每天于08:00、16:00各投料1次,投料后进行捡蛋,试验期间鹅只自由采食和饮水。饲粮营养水平中,预混料为每千克饲粮提供:VA 8 250 IU,VD33 000 IU,VE 20 mg,VK32 mg,VB11.5 mg,VB26.25 mg,VB62.45 mg,VB120.02 mg,烟酸 29.5 mg,D-泛酸钙 8 mg,叶酸 1 mg,生物素 0.08 mg,铁 81 mg,铜 5.8 mg,锌 63 mg,猛 95.5 mg,硒 0.41 mg,碘 0.72 mg,钴 0.36 mg。表1

1.2 方 法

1.2.1 产蛋性能

每天准确记录生产数据,记录日投料量、剩料量、产蛋数、蛋重、长径、短径及不合格蛋数(畸形蛋、沙皮蛋等),根据试验期记录的基础数据,计算平均日采食量、产蛋率、平均蛋重、日产蛋量、料蛋比、种蛋合格率以及蛋形指数。

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.2.2 孵化性能

每日收集种蛋并进行编号,剔除不合格种蛋,分组放入蛋库,每7 d入孵一批种蛋,入孵前记录各重复的入孵蛋数,试验期内进行8批孵化。在入孵第7、14 d进行照蛋,挑出不合格蛋(无精蛋、死精蛋以及死胎蛋),记录每次入孵蛋数、受精蛋数、出雏数及健雏数,并计算受精率、受精蛋孵化率以及健雏率。

1.2.3 血清生殖激素

随机选取处于产蛋期的伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅母鹅各40只,翅下静脉采血5 mL于无抗凝剂的真空采血管中,3 000 r/min离心10 min,吸取上层血清于1.5 mL离心管中,置于-20℃冰箱保存用于血清生殖激素的测定。

用双抗体夹心法ELISA试剂盒对伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅的血清生殖激素水平进行测定,包括促黄体素(LH)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、孕酮(P4)、催乳素(PRL)和促性腺激素释放激素(GnRH)的浓度。

1.2.4 基因表达量

随机选取处于产蛋期的伊犁鹅母鹅和霍尔多巴吉鹅母鹅各4只,屠宰后快速采集下丘脑、垂体、卵巢及输卵管组织,经PBS冲洗处理后,放入含有RNA保存液的冻存管中标记,4℃静置过夜,随后再放到-80℃保存,用于各组织样品中总RNA的提取。

选取5个候选基因为检测对象,采用实时荧光定量PCR定量检测下丘脑、垂体、卵巢和输卵管中基因BMP2、BMP6、ENO1、EP300和MIS的表达。以GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)为内参基因作为对照,根据GenBank中目标基因的mRNA序列,基因特异性引物采用Primer5.0设计,通过NCBI比对引物特异性,并委托上海生工生物技术有限公司合成。使用总RNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)从各个组织中提取总RNA。通过凝胶电泳评价RNA的提取质量。使用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)cDNA合成试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)按照制造商的说明逆转录合成第一链cDNA。反应体系(20 μL)为:cDNA(适度稀释)2.5 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)10 μL,ddH2O 6.7 μL。反应程序为:95℃ 5 min;95℃ 10 s,60℃ 30 s,40个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达水平[10]。表2

表2 荧光定量PCR引物信息

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2016软件整理,所有数据均采用SPSS 19.0软件分析。其中繁殖性能和血清激素浓度使用独立样本T检验,各组织中基因表达水平使用单因素方差和独立样本T检验,繁殖性能和血清激素浓度的结果均使用平均值±标准差(Mean±SD)来表示,各组织中基因表达水平的结果使用平均值±标准误(Mean±SEM)表示,以P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著,P<0.05为差异不显著,使用GraphPad Prism8软件绘图。

2 结果与分析

2.1 伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅生产和孵化性能的比较

研究表明,伊犁鹅的产蛋率、日产蛋量、平均日采食量、平均蛋重、蛋形指数、受精率和受精蛋孵化率分别显著或极显著低于霍尔多巴吉鹅45.79%(P<0.01)、45.40%(P<0.01)、21.11%(P<0.01)、13.46%(P<0.01)、2.63%(P<0.01)、18.89%(P<0.01)和12.34%(P<0.05),伊犁鹅的料蛋比极显著高于霍尔多巴吉鹅37.31%(P<0.01),伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅的商品蛋合格率和健雏率差异不显著(P>0.05)。表3

表3 伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅生产和孵化性能的比较

2.2 伊犁鹅与霍尔多巴吉鹅血清生殖激素水平的比较

研究表明,伊犁鹅血清中的GnRH、LH、FSH、E2和P4水平分别显著或极显著低于霍尔多巴吉鹅12.32%(P<0.01)、18.93%(P<0.01)、21.07%(P<0.01)、24.03%(P<0.01)和6.9%(P<0.05),伊犁鹅血清中的PRL水平显著高于霍尔多巴吉鹅12.07%(P<0.05)。表4

表4 伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅血清生殖激素水平差异

2.3 基因表达量

2.3.1 BMP2、BMP6、MIS、ENO1、EP300基因在伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅的不同组织器官中的表达

研究表明,对于伊犁鹅,BMP2基因在卵巢中的表达量极显著高于下丘脑、垂体和输卵管(P<0.01),BMP6基因在卵巢和输卵管中的表达量极显著高于下丘脑和垂体(P<0.01),MIS基因在输卵管中的表达量均极显著高于其他组织(P<0.01),ENO1基因在4种组织中的表达量差异均不显著(P>0.05),EP300基因在输卵管中的表达量均显著高于其他组织(P<0.05)。对于霍尔多巴吉鹅,BMP2和BMP6基因在卵巢中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01),在输卵管中的表达量均显著高于下丘脑和垂体(P<0.05),MIS、ENO1和EP300基因在输卵管中的表达量均极显著高于其他组织(P<0.01),其余组织间的表达量差异均不显著(P>0.05)。表5

表5 5种基因在伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅的不同组织的表达

2.3.2 伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅在相同组织器官中BMP2、BMP6、MIS、ENO1、EP300基因表达量的比较

研究表明,在下丘脑中,伊犁鹅的ENO1和MIS基因的表达量均显著或极显著低于霍尔多巴吉鹅(P<0.05或P<0.01);在垂体中,伊犁鹅的MIS、ENO1和BMP6基因的表达量显著或极显著低于霍尔多巴吉鹅(P<0.05或P<0.01);在卵巢中,伊犁鹅的ENO1和MIS基因的表达量显著或极显著低于霍尔多巴吉鹅(P<0.05或P<0.01);在输卵管中,伊犁鹅的ENO1和EP300基因显著或极显著低于霍尔多巴吉鹅(P<0.05或P<0.01),其余基因表达量间均无显著差异(P>0.05)。图1

注:未标注为差异不显著,*代表差异显著(P<0.05),**代表差异极显著(P<0.01)

3 讨 论

3.1 伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅生产和孵化性能的比较

鹅的产蛋率是反映其繁殖性能的重要指标,主要受品种、环境和饲养管理等因素的影响[11],日产蛋量综合考虑了产蛋率和蛋重两个变化因素,能够反映出某一品种禽类的产蛋性能[12]。研究发现,蛋重本身与受精率和受精蛋孵化率之间呈正相关,随着蛋重的增大,受精率和受精蛋孵化率出现增加的趋势[13]。苏蕊[14]对浙东白鹅、四川白鹅和豁眼鹅的种蛋特征及其孵化效果进行比较分析,结果发现不同品种鹅的蛋重和蛋形指数对孵化率影响较大。谢燕妮等[15]在相同饲养条件下对地方品种巴马绿壳蛋鸡和国外引进培育品种罗曼粉蛋鸡、海兰褐蛋鸡进行产蛋性能的比较发现,巴马绿壳蛋鸡的平均蛋重和平均产蛋率均显著低于罗曼粉蛋鸡和海兰褐蛋鸡,其料蛋比显著高于罗曼粉蛋鸡和海兰褐蛋鸡。葛盛芳等[16]在相同饲养条件下,对我国地方品种绍兴鸭和国外引进品种康贝尔鸭进行比较研究发现,康贝尔鸭的产蛋率略低于绍兴鸭,但其蛋重显著高于绍兴鸭,日产蛋量显著高于绍兴鸭,表明康贝尔鸭的产蛋性能优于绍兴鸭。孙永峰等[17]对卡洛斯鹅、皖西白鹅及籽鹅进行比较研究,结果发现品种对鹅的产蛋数影响较大,籽鹅的平均产蛋数最高,受精率显著高于皖西白鹅和卡洛斯鹅。段修军等[18]对豁眼鹅、莱茵鹅和扬州鹅进行产蛋率、受精率、孵化率等指标的比较,结果显示豁眼鹅的繁殖性能最高,扬州鹅居中,莱茵鹅最低。

研究中,伊犁鹅的产蛋率、日产蛋量、平均日采食量、平均蛋重、蛋形指数、受精率和受精蛋孵化率分别显著或极显著低于霍尔多巴吉鹅,这主要是与鹅品种间的特异性有关。而伊犁鹅的料蛋比极显著高于霍尔多巴吉鹅,与谢燕妮等[15]研究发现地方品种巴马绿壳蛋鸡的料蛋比高于国外引进培育品种这一结果相似。可能是相对于霍尔多巴吉鹅,伊犁鹅未经历过严格的人工选育,造成伊犁鹅的产蛋和孵化性能低于霍尔多巴吉鹅,料蛋比高于霍尔多巴吉鹅。

3.2 伊犁鹅与霍尔多巴吉鹅血清生殖激素水平的比较

生殖激素对家禽的卵泡发育和排卵等生理过程具有重要的意义[19]。下丘脑释放促性腺激素释放激素(GnRH),刺激垂体前叶分泌促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)和催乳素(PRL),促进排卵及卵泡发育[20],进而调节孕酮(P4)和雌二醇(E2)的分泌,P4与E2能够协同促进母禽产蛋,各个激素共同调控鹅的繁殖活动[21]。张可山等[22]发现,在产蛋期时,四川白鹅的GnRH水平显著高于溆浦鹅,提示GnRH的水平差异可能与鹅的产蛋量有关。研究发现[23]FSH能够促进卵巢内卵泡的发育与成熟,提高鸡胚卵巢生殖细胞的增殖活性,生殖细胞数目显著增加,表示FSH可以提高禽类的生殖细胞的增殖活性。Sun等[24]发现,血清中LH的浓度可能与卵巢和输卵管的成熟度有关。Etches[25]等发现,在鸡中P4分泌的增加与排卵周期中LH释放的增加相对应,两种生殖激素可以促进卵泡成熟和排卵。Yang等[26]研究结果表明,LH和P4的分泌水平不同是导致鹅卵泡发育存在差异的原因,高浓度的LH和P4可能促进等级前卵泡向等级卵泡的发育,提高产蛋量。李晓坤等[27]研究表明,E2水平与产蛋率和孵化率存在极显著相关。研究中,伊犁鹅血清中的GnRH、LH、FSH、E2和P4水平均显著或极显著低于霍尔多巴吉鹅,伊犁鹅在卵泡的生长发育和排卵能力方面弱于霍尔多巴吉鹅,这与研究中伊犁鹅的产蛋率、日产蛋量显著低于霍尔多巴吉鹅的结果相一致。

PRL是引起家禽就巢的主导激素,PRL分泌水平的高低对鹅繁殖活动的调控机制有着不同程度的影响[28]。高水平的PRL通过抑制GnRH的分泌,来降低FSH和LH的分泌,从而抑制禽类卵泡的发育,导致禽类卵巢中的卵泡发生萎缩闭锁的情况,使其产生就巢行为[29]。陈习中等[30]研究皖西白鹅的生殖激素水平,发现PRL有很强的抗性腺作用,也证明PRL浓度水平对鹅的“抱性”有促进作用。研究中,伊犁鹅血清中的PRL水平显著高于霍尔多巴吉鹅(P<0.05),可能和伊犁鹅有很强的就巢性有关。

3.3 基因表达量差异

BMP2和BMP6是骨形态蛋白(BMP)家族的成员,属于转化生长因子β(TGF-β)超家族[31]。TGF-β超家族成员在动物卵母细胞的增殖和分化中发挥重要作用,并为颗粒细胞(GCs)和卵母细胞之间提供细胞间通讯,一些BMP因子在哺乳动物的卵巢和卵泡发育中发挥着重要作用[32]。Ying等[33]发现,BMP2在原始胚胎细胞的形成和卵巢卵泡发育中起着重要作用。BMP2基因在初级和次级颗粒细胞[34]以及窦卵泡的卵泡膜细胞和卵母细胞[35]中均得到了表达。Zhu等[36]研究发现BMP2的高表达可以抑制山羊颗粒细胞的凋亡。Yan等[37]对天府农华麻鸭的性腺轴组织进行转录组分析,结果表明BMP2是与鸭产蛋性能相关的候选基因。Huang等[38]对宁海土鸡的卵巢进行转录组分析,预测了9个与产蛋调控有关的基因,其中包含BMP6基因。研究发现[39]BMP6主要来自于卵母细胞,可以促进牛的颗粒细胞分泌雌二醇和抑制素,同时抑制孕酮的分泌,从而延缓卵泡闭锁。李玉春[40]研究BMP6基因在猪卵泡中的表达,结果发现BMP6在猪卵巢中表达,并有可能影响卵泡发育。

研究中,伊犁鹅垂体中的BMP6基因的表达量显著低于霍尔多巴吉鹅,伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅的BMP2基因和BMP6基因均在卵巢中的表达量最高,在其他组织中,两个基因的表达量均无显著差异,BMP2和BMP6基因可能主要在卵巢中发挥调控作用,通过调节卵泡的发育和排卵来调控鹅的产蛋性能。

α-烯醇化酶1(ENO1)是糖酵解途径中的关键蛋白水解酶,在细胞的新陈代谢中发挥着重要作用,广泛存在于动物机体的各个组织和器官之中[41]。郑梦月等[42]研究不同繁殖期鹅的下丘脑、垂体和卵巢组织中ENO1的表达规律,发现在产蛋期时,四川白鹅卵巢中ENO1的表达量均显著高于下丘脑和垂体。季华[43]对籽鹅产蛋性状的候选基因进行分析,ENO1基因对籽鹅的产蛋性能具有显著影响。研究中ENO1基因在两种鹅的输卵管中表达量最高,其次是卵巢,且ENO1基因在霍尔多巴吉鹅中的表达量高于伊犁鹅。禽类的卵巢是产生卵细胞的部位,输卵管是运送卵细胞和提供受精的部位,也是卵子的受精部位[44]。研究结果提示ENO1可能参与调控鹅的卵巢功能、卵泡发育和受精繁殖等过程。

抗苗勒氏管激素(AMH)又称为苗勒管抵制物(MIS)[45]。AMH是一种转化生长因子,仅在性腺中特异表达,在雌性动物中AMH主要参与调节原始卵泡的募集和卵泡选择过程[46]。陈蓉等[47]检测了连城白鸭不同等级卵泡中AMH等基因的表达情况,发现在鸭等级前卵泡中AMH基因的高表达量有助于维持颗粒细胞未分化的状态,抑制原始卵泡的初始募集,进而维持卵泡的发育潜能。刘芮佳等[48]发现AMH可影响卵泡对FSH的敏感性,在卵泡选择过程中起关键作用,从而调节产蛋量。Shen等[49]通过全基因组关联分析筛选了影响鸡卵泡数的候选基因,结果发现AMH基因在鸡的卵泡发育中起到了关键作用。E1A结合蛋白P300(EP300)作为组蛋白乙酰转移酶,在细胞增殖和分化过程中起重要作用。陈宇[50]对猪的全基因组SNP筛选时发现,EP300可能是与猪繁殖性状相关的候选基因。

研究中MIS和EP300基因在伊犁鹅和霍尔多巴吉鹅输卵管中的表达量均显著高于其他组织;MIS基因表达量在霍尔多巴吉鹅的下丘脑、垂体和卵巢中均显著高于伊犁鹅;EP300基因表达量在霍尔多巴吉鹅的在输卵管中显著高于伊犁鹅。

4 结 论

伊犁鹅的产蛋率、受精率和受精蛋孵化率等均低于霍尔多巴吉鹅,伊犁鹅血清GnRH、LH、FSH、E2和P4水平均显著或极显著低于霍尔多巴吉鹅,PRL水平显著高于霍尔多巴吉鹅。BMP2、BMP6、MIS、ENO1、EP300基因表达量之间的差异可能影响了伊犁鹅与霍尔多巴吉鹅之间的卵泡发育,继而调控鹅的繁殖性能。