万寿菊水提物对砷致胰岛β细胞毒性作用的影响研究*

刘帼芬，张晓莉，牟亚豪，代 娇，谷仕艳

1.大理大学公共卫生学院，云南 大理 671000；2.曲靖医学高等专科学校，云南 曲靖 655000

万寿菊为一年生草本植物，花色呈橘黄色，具有较高的观赏价值，同时万寿菊花瓣含有丰富的叶黄素，并含有黄酮和多酚等多种活性物质，而兼具良好的药用价值。经研究证实，万寿菊花提取物可用于对抗白内障、防止老年视黄斑退化、降低患癌率和防治冠心病等，在保健食品、化妆品、医药等行业领域应用较为普遍［1-3］。此外，也有研究证实万寿菊花水提物可在一定程度上恢复肾组织抗氧化酶活性，降低抗肿瘤药物对肾脏的氧化损伤［4］，且有研究显示，万寿菊花提取物具有一定的抗氧化活性［5-6］。然而，万寿菊花水提物的具体抗氧化功能及机制还缺乏深入的探讨，这在一定程度上限制了它的使用和推广。

砷（As）是自然界中广泛存在的有毒类金元素，主要通过消化道、呼吸道和皮肤接触进入机体，引起皮肤癌、肺癌、糖尿病以及神经退行性等多种疾病的发生发展［7］。氧化应激是多种疾病的分子病理机制，同时也被认为是砷发挥毒性作用最主要的机制之一。当无机砷进入细胞内，可引起抗氧化物质谷胱甘肽的快速耗竭并使谷胱甘肽合成酶失活，这使得细胞内大量活性氧（ROS）得不到有效清除而蓄积，蛋白质、核酸和脂质等生物大分子被氧化修饰而失去基本功能，引起细胞功能的紊乱，最终表现为细胞的死亡［8］。目前未见万寿菊花水提物能否拮抗或恢复砷引起的氧化损伤的报道。本研究以胰岛β 细胞NIT-1 细胞为模型，首先评估万寿菊花水提物本身的细胞毒性作用，接着探讨万寿菊花水提物对砷所致细胞毒性的影响，明确万寿菊花水提物能否拮抗砷诱导的毒性损伤，为将万寿菊更好地用于疾病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

荧光显微镜（日本Nikon公司）；循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；真空冷冻干燥机（Scientz-ND，宁波新芝生物）；多功能荧光酶标仪（SP-Max3500F，上海闪谱生物司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器）；As2O3（北京坛墨质检科技有限公司）；1640 细胞培养基、胎牛血清（上海索莱宝）；CCK8 检测试剂盒（南京凯基生物）；ROS 活性氧检测试剂盒（北京雷根）；细胞凋亡-Hoechst 染色试剂盒（上海碧云天）；实验所需其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 万寿菊花水提物提取 万寿菊干花放入中药粉碎机中进行粉碎，粉碎时间为1 min，将得到的万寿菊花粉末过0.25 mm（60目）标准网孔筛获得万寿菊60目粉。称取万寿菊60 目粉10 g，加入20 倍量（200 mL）蒸馏水，水浴100 ℃2 h 提取3 次，合并三次滤液，将滤液在45 ℃减压条件下旋蒸，至旋蒸瓶中约有1 mL 左右的旋蒸液为止（旋蒸瓶壁上如有粉末贴壁，用55KHz超声震荡处理），用吸管将液体移至培养皿中，用保鲜膜包裹，并用针头扎孔放入冰箱-20 ℃冷冻7 h 以上，后迅速放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥12 h，得到万寿菊水溶性成分的冻干粉末，4 ℃保存备用，在临用时以1640培养基配成50 mg/mL的储备液。

1.2.2 细胞培养 小鼠胰岛素瘤β 细胞（NIT-1，广州吉妮欧生物）在饱和湿度、5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养，所用培养液为含10%胎牛血清的1640 培养液，细胞生长覆盖培养瓶壁达到80%～90% 时，进行传代处理。

1.2.3 CCK-8 检测细胞存活率 按1×104 个/100μL 将细胞接种于96 孔板，贴壁后分别用As2O3（0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/L）和万寿菊水提物（0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28mg/mL）单独处理细胞，根据处理后的细胞存活率，设置As2O3 和万寿菊水提物的共处理组（As2O3和万寿菊水体物混合处理）和后处理组（As2O3处理结束后再给予万寿菊水提物处理），处理结束后弃液，每孔加90 μL 培养液和10 μL CCK-8 试剂，在细胞培养箱中孵育4 h 后，以荧光酶标仪在450 nm 的波长下测吸光度值（A450），根据公式：细胞存活率（%）=处理组A450/对照组A450×100%计算细胞存活率。

1.2.4 细胞凋亡测定 按5×105个/孔接种细胞，贴壁后分别给予3.2 mg/L As2O3、0.08 mg/mL 万寿菊水提物以及3.2 mg/L As2O3和0.08 mg/mL 的万寿菊花后处理24 h，弃液后每孔加入500 μL Hoechst 固定液，10 min 后去除，加入1 mL PBS 清洗2 次，最后避光加入500 μL 染色液孵育5 min。荧光显微镜下观察和拍照，正常细胞的细胞核为均一蓝色，凋亡细胞则细胞核皱缩且颜色变白发亮。按公式计算细胞凋亡率：细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/200×100%。

1.2.5 细胞ROS 活性测定 细胞经As2O3和万寿菊水提物处理后，每孔加入含有DCFH-DA 探针浓度为10 μM 的培养基1 mL，37℃孵育20 min后，在荧光显微镜下观察和拍照，图片用Image J 软件进行定量分析。ROS 平均荧光强度=光密度总和/待测细胞面积，以对照组的平均荧光强度进行校正。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 进行数据分析。所有实验均独立重复3次，结果以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较用最小显著法（LSD-t），方差不齐的数据采用Kruskal-Wallis 秩和检验（H）检验。两两比较用完全随机设计多个样本间的秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 万寿菊水提物活性成分提取率及对细胞存活率的影响

万寿菊水提物冻干产物呈棕黄色并具有一定的黏性，三次提取物质量分别为3.69 g、3.74 g 和3.75 g，平均浸提率为37.27%。NIT-1 细胞经0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 mg/mL 万寿菊水提物作用24 h 后，细胞存活率依次是100.00%、104.05%、109.43%、92.47%、77.36%、49.44%、22.08%。0.08 mg/L 组的存活率高于“0”组，0.16、0.32、0.64、1.28 mg/mL 组的存活率低于“0”组，差异有统计学意义（P＜0.05），0.4 mg/mL 组与“0”组比较，差异无统计学意义（P=0.243）；随着万寿菊水提物浓度升高，NIT-1 细胞的存活率呈现先上升后下降的趋势，差异有统计学意义（F=190.206，P＜0.05），见图1。

图1 万寿菊水提物对NIT-1细胞存活率的影响

2.2 As2O3对细胞存活率的影响

NIT-1 细胞经0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/L As2O3作用24 h 后，细胞存活率分别为100.00%、96.11%、93.79%、74.92%、63.02%、52.75%、42.22%，As2O3处理组与“0”组相比，除0.4 mg/L 组外，细胞存活率均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 As2O3对NIT-1细胞存活率的影响

2.3 万寿菊与As2O3共处理对细胞存活率的影响

0.08 mg/L 万寿菊水提物处理细胞24 h 后的细胞存活率为105.93%，1.6 mg/L As2O3和3.2 mg/L As2O3细胞存活率分别为76.28%和59.40%，而0.08 mg/L 万寿菊和1.6 mg/L As2O3共处理细胞存活率为39.44%，0.08 mg/L 万寿菊和3.2 mg/L As2O3共处理细胞存活率为34.64%，共处理组细胞存活率均低于砷单染和万寿菊单染组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 万寿菊与As2O3共处理对NIT-1细胞存活率影响情况

2.4 万寿菊后处理对As2O3降低细胞存活率的影响

万寿菊水提物细胞存活率为107.00%，1.6 mg/L As2O3和3.2 mg/L As2O3细胞存活率分别为76.32%和56.54%，1.6 mg/L As2O3处理结束再给予0.08 mg/L 万寿菊水提物处理组中，细胞存活率为62.14%，与1.6 mg/L As2O3处理组相比，细胞存活率下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；3.2 mg/L As2O3处理结束再给予0.08 mg/L 万寿菊水提物处理，细胞存活率为66.53%，与3.2 mg/L As2O3处理组相比，细胞存活率上升，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 万寿菊后处理对As2O3降低NIT-1细胞存活率影响情况

2.5 万寿菊水提物对As2O3引起细胞凋亡的影响

“0”组细胞贴壁良好，细胞形态正常，细胞核蓝色均一，凋亡细胞较少；万寿菊水提物处理组细胞状态与“0”组相近，而As2O3组细胞贴壁不良，细胞核呈碎片状，且呈致密浓染，颜色发白，呈现典型凋亡状态；万寿菊水提物后处理组与As2O3组比较，凋亡细胞少于As2O3组。经观察和计数，0 组、万寿菊组、As2O3组和联合处理组的细胞凋亡率依次是8.67%、5.5%、21.33%、17.17%，联合处理组细胞凋亡率高于“0”组和万寿菊水提物组，但低于As2O3组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图5 万寿菊后处理对砷所致NIT-1细胞凋亡的影响

2.6 万寿菊水提物对As2O3升高细胞ROS含量的影响

ROS 检测结果如图6A 所示，万寿菊组绿色荧光信号与“0”组相近，As2O3组绿色荧光信号最强，联合处理组绿色荧光信号弱于As2O3组但强于“0”组与万寿菊水提物处理组。经定量，As2O3组（1.12 倍）和联合处理组（1.06倍）的ROS 活性高于“0”组（P＜0.05），联合处理组ROS活性低于As2O3组（P＜0.05），详见图6B。

图6 万寿菊后处理对砷增加NIT-1细胞中ROS含量的影响

3 讨论

本研究结果显示，万寿菊水提物在较高浓度下会对细胞产生毒性作用，提示我们在实际应用过程中，要关注万寿菊花提取物的使用浓度。

无机砷作为一种剧毒物质，能以剂量依赖的方式诱导细胞内ROS 的蓄积，进而引发细胞凋亡或自噬［8-10］，表现出较强的毒性作用，而这种毒性作用可在一定程度上被逆转，如叔丁基对苯二酚可通过激活Nrf2通路而增强细胞抵御氧化损伤的能力，进而降低无机砷对细胞的毒性；姜黄素可有效拮抗无机砷对大鼠睾丸生殖细胞的凋亡诱导作用；西红花酸可对无机砷诱导的心肌细胞损伤产生保护作用；玫瑰香葡萄果皮提取物可提高小鼠睾丸组织的抗氧化能力，缓解砷的雄性生殖毒性；葡萄籽提取物白藜芦醇在低剂量时可拮抗无机砷的毒性作用，促进细胞存活，而在高剂量时则能与无机砷产生协同作用，共同杀伤肿瘤细胞。以上这些研究表明，无机砷产生的细胞毒性可被抗氧化剂或者含抗氧化物质的提取物在一定程度上逆转，而这些物质与无机砷的联合作用方式有预处理（无机砷给药前用这些物质处理细胞），共处理（与无机砷同时给药）和后处理（无机砷处理结束后给予）3 种。本研究为明确万寿菊提取物对无机砷毒性作用的影响，选择共处理和后处理两种方式处理后检测细胞存活率，结果显示，在砷和万寿菊水提物共处理细胞时，细胞存活率低于万寿菊和砷单独给药的存活率，提示万寿菊的水提物成分可在一定程度上增强砷的细胞毒性，表现出联合杀伤作用。在本研究中我们观察到在砷处理后再给予万寿菊水提物处理时，万寿菊水提物可有效恢复As2O3引起的细胞毒性，表现为促进细胞存活，抑制细胞凋亡以及降低ROS的蓄积，表明万寿菊水提物能在一定程度上恢复无机砷引起的细胞损伤。在共处理时，万寿菊水提物和As2O3表现出联合杀伤作用，可能是由于万寿菊水提物中的某些成分可增强As2O3的毒性；也有可能是由于水提物成分中含有多糖成分，而万寿菊多糖成分已被证实在体外有一定的抑瘤活性［8］。当然，万寿菊水提物对As2O3毒性的增强作用还需要进一步研究，比如更换处理时间、处理浓度，甚至选用不同的细胞株，以更清晰地阐明万寿菊水提物在共处理的方式下对As2O3毒性的影响。而后处理过程中，排除了As2O3和万寿菊水提物之间的相互作用，观察到万寿菊水提物可有效恢复As2O3引起的细胞损伤，这可能与万寿菊水提物成分具有抗氧化特性有关［5-6］。

综上所述，万寿菊提取物在低浓度下刺激细胞生长，高浓度则使细胞存活率下降，As2O3能以浓度依赖的方式降低细胞存活率，诱导细胞凋亡，万寿菊后处理可有效逆转As2O3所致的细胞毒性。本研究可为今后万寿菊水溶性成分修复细胞损伤的研究提供一定的参考依据，同时为合理利用和开发万寿菊属植物资源，实现万寿菊的综合利用提供理论基础。