两种新型生物降解地膜对番茄生长及土壤微生物、酶活性的影响

路露，韩荧，刘梓桐，钱晶晶，闫妍，孙玉军

(1. 安徽科技学院，安徽凤阳 233100；2. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

地膜具有增温、保墒、防草、抗病等作用，广泛应用于农业生产实际，自1978 年引入我国以来，对我国的农业生产方式、区域种植结构产生了巨大影响。 预计到2025 年，我国地膜覆盖面积将达到2340 万hm2[1]，但普通聚乙烯地膜由于长期不科学的田间操作导致农田土壤环境加剧恶化，残膜污染问题呈现加重趋势[2]。 农田残膜会破坏土壤结构、影响土壤水分运输和养分循环[3]，导致耕地质量、作物产量和品质下降，危害食品安全[4]。

生物降解地膜是解决地膜残留污染的重要途径之一[5]，其在自然环境中可以通过微生物降解成二氧化碳和水等[6]。 腐殖酸是一种抗菌、无毒无害、天然有机土壤改良剂[7]，可以与土壤中的矿物质结合，增加土壤团粒结构。 研究表明，番茄栽培时施用腐殖酸能够促进番茄生长发育及光合效率，改良土壤理化性质，还能对番茄起到壮苗作用[8，9]。

土壤微生物作为土壤的重要组成部分对于维持土壤生态具有重要作用，其对环境的变化较为敏感，是评价土壤质量、肥力的重要指标[10]。 已有研究显示，覆盖降解地膜可增加土壤酶活性和微生物数量，改变土壤微生物群落结构[11，12]；秋季覆盖地膜在东北雨养区玉米种植中可以显著增加土壤微生物的丰富度及多样性[13]，在辣椒种植中覆盖地膜可以提高土壤细菌丰度和均匀度指数[14]。 以往研究多数集中在地膜覆盖对作物生长、产量、土壤理化性质的影响上，对土壤微生物、土壤酶活性的研究较少。

本试验通过研究在日光温室番茄栽培中覆盖普通聚乙烯地膜和PBAT/PLA 腐殖酸、PBAT/PLA 木质素生物降解地膜对土壤微生物群落结构、物种丰度、土壤酶活性及番茄植株生长的影响差异，为评价覆盖生物降解地膜对土壤微生物群落结构的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验设计

试验于2021 年9 月—2022 年1 月在中国农业科学院南口中试基地日光温室进行。 番茄品种为甜脆脆(北京富万家农业科技发展有限公司)。FZS(PBAT/PLA 腐殖酸生物降解地膜)、MZS(PBAT/PLA 木质素生物降解地膜)，山东农业大学化学与材料科学学院协助提供生物降解地膜配方，由山东清田塑工有限公司生产；PE(聚乙烯地膜)，厚度10 μm，购自山东清田塑工有限公司。MZS 配方:PBAT 90 wt%，PLA 5 wt%，木质素5 wt%，厚度10 μm。 FZS 配方:PBAT 90 wt%，PLA 5 wt%，腐殖酸5 wt%，厚度10 μm。

整畦种植，畦宽120 cm，畦长750 cm，每畦种植35 株，株距40 cm，小行距40 cm，大行距80 cm。 每666.7m2种植2600 株。 番茄苗于2021 年9 月4 日定植，期间供水与供肥量均相同。 每个处理3 次重复。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 土壤微生物测序 种植结束时采用“S”形取样法，对0 ～20 cm 耕层土壤进行样品采集，每个处理3 个重复，编号封装带回实验室-80℃保存。 使用TGuide S96 磁珠法土壤/粪便基因组DNA 提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，型号:DP812]提取土壤DNA。 使用引物27F_(16S-F)(5＇- AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3＇)、1492R_(16S-R) (5＇-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3＇)扩增细菌16S rRNA 序列。 其反应体系(30 μL):基因组DNA 1.5 μL，nuclease-free water 10.5 μL，KOD ONE MM 15 μL，正反引物各1.5 μL。 反应程序:95℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，循环25 次；72℃延伸2 min。 使用引物ITS1F:5＇-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA - 3＇、 ITS4: 5＇ - TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇扩增真菌ITS 序列。 其反应体系(30 μL):基因组DNA 1.5 μL，nucleasefree water 11.7 μL，KOD ONE MM 15 μL，正反引物各0.9 μL。 反应程序:95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环8次；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环24 次；72℃延伸5 min。 测序方法:使用PacBio Binding kit(Pacbio，USA)对上机文库进行上机前的结合，使文库结合上Primer(Pacbio，USA)及Polymerase(Pacbio，USA)；将最终反应产物进行AMpure PB Beads(Pacbio，USA)纯化后置于Sequel Ⅱ(Pacbio，USA)测序仪上进行上机测序，测序工作由北京百迈客生物科技有限公司完成。

使用FUNGuild(Fungi Functional Guild)进行真菌功能预测，使用PICRUSt2 软件进行细菌功能预测。

1.2.2 土壤酶活性测定 种植结束时，采用“S”形取样法，对0 ～20 cm 耕层土壤进行样品采集，每个处理重复3 次。 过氧化氢酶和蔗糖酶活性采用北京盒子生工科技有限公司试剂盒测定。

1.2.3 番茄生长指标测定 株高、茎粗:番茄植株打顶前采用卷尺测量株高、游标卡尺测量茎粗，每个处理选取6 株番茄进行测定。

节间距:采用卷尺测量番茄植株三穗花下的平均节间长度，每个处理选取6 株番茄进行测定。

1.3 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010 软件处理数据，GraphPad Prism 8.4.2 作图，DPS 软件对数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物群落OTU 水平的主成分分析

土壤真菌群落PCA 分析显示，第一、第二轴对各样本的解释度分别为76.02%和17.66%。 处理前土壤(CK)和PE、MZS、FZS 地膜的土壤样本各自聚为一类，说明各地膜处理重复间差异较小(图1A)。 土壤细菌群落PCA 分析显示，第一、第二轴对各样本的解释度分别为35.82%和19.28%。CK 和PE、MZS、FZS 地膜的土壤样本各自聚为一类，说明各地膜处理重复间差异较小(图1B)。

图1 土壤微生物群落OTU 水平主成分分析

2.2 覆盖聚乙烯和不同生物降解地膜对土壤真菌、细菌门水平物种丰度的影响

土壤真菌门水平物种丰度排名前10 的主要有Ascomycota(子囊菌门)、Chytridiomycota(壶菌门)、Mortierellomycota(被孢霉门)、Basidiomycota(担子菌门)、unclassified Fungi(未分类真菌)、Rozellomycota(罗兹菌门)、Glomeromycota(球囊菌门)、Calcarisporiellomycota、Olpidiomycota(油壶菌门)、Zoopagomycota(捕虫霉门)。 覆盖MZS 地膜Chytridiomycota 的相对丰度高于覆盖PE 和FZS地膜；覆盖FZS 地膜的Ascomycota 相对丰度高于覆盖PE 和MZS 地膜(图2A)。

图2 覆盖聚乙烯和不同生物降解地膜土壤真菌、细菌门水平相对丰度

土壤细菌门水平物种丰度排名前10 的为Proteobacteria(变形菌门)、Acidobacteriota(酸杆菌门)、Bacteroidota(拟杆菌门)、unclassified Bacteria(未分类细菌)、Nitrospirota(硝化螺旋菌门)、Gemmatimonadota(芽单胞菌门)、Verrucomicrobiota(疣微菌门)、Planctomycetota(浮霉菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Actinobacteriota(放线菌门)。覆盖FZS 地膜的Verrucomicrobiota 和Bacteroidota相对丰度高于覆盖PE 和MZS 地膜(图2B)。

2.3 覆盖聚乙烯和不同生物降解地膜对土壤真菌、细菌群落门类的影响

处理前土壤(CK)和覆盖PE、MZS、FZS 地膜土壤拥有8 个共有真菌门类，覆盖PE 地膜拥有1个特有真菌门类(图3A)。 处理前土壤(CK)和覆盖PE、MZS、FZS 地膜土壤拥有26 个共有细菌门类，覆盖PE、MZS、FZS 地膜拥有1 个共有细菌门类(图3B)。

图3 覆盖聚乙烯和不同生物降解地膜土壤真菌、细菌群落门类

2.4 土壤真菌FUNGuild 功能预测和土壤细菌PICRUSt2 功能预测

土壤真菌FUNGuild 功能预测Guild 层级排名前10 的有:Undefined Saprotroph(未定义腐生菌)、Wood Saprotroph(木腐生菌)、Dung Saprotroph(排泄物腐生菌)、Plant Pathogen(植物病原菌)、Plant Saprotroph(植物腐生菌)、Ectomycorrhizal(外生菌)、Animal Pathogen(动物病原菌)、Fungal Parasite(真菌寄生菌)、Arbuscular Mycorrhizal(丛枝菌根)、Endophyte(内生菌)，见图4A。

图4 土壤真菌FUNGuild 功能预测(A)和土壤细菌PICRUSt2 功能预测(B)

通过与KEGG 数据库进行比对，土壤细菌level 2 水平排名前10 的功能有:Global and overview maps、Carbohydrate metabolism(碳水化合物代谢)、Amino acid metabolism(氨基酸代谢)、Energy metabolism(能量代谢)、Metabolism of cofactors and vitamins(辅助因子和维生素代谢)、Translation(翻译)、Nucleotide metabolism(核苷酸代谢)、Membrane transport(膜转运)、Signal transduction(信号转导)、Replication and repair(复制和修复)，见图4B。

2.5 覆盖聚乙烯和不同生物降解地膜对土壤酶活性的影响

覆盖PE 和FZS、MZS 地膜对土壤过氧化氢酶活性的影响没有显著差异；覆盖FZS 和MZS 地膜的蔗糖酶活性分别达到5.24 U/g 和5.38 U/g，较覆盖PE 地膜分别显著提高7.60%和10.47%(表1)。

表1 覆盖聚乙烯和不同生物降解地膜对土壤酶活性的影响

2.6 覆盖聚乙烯和不同生物降解地膜对番茄植株生长的影响

由表2 可知，覆盖PE 和FZS、MZS 地膜对番茄株高和节间距的影响无显著差异；茎粗依次为FZS 地膜＞MZS 地膜＞PE 地膜；相较于覆盖PE 和MZS 地膜，覆盖FZS 地膜番茄茎粗分别显著增加5.99%和3.14%。

表2 覆盖聚乙烯和不同生物降解地膜对番茄植株生长的影响

3 讨论

覆盖生物降解地膜可以通过改变微气候而间接影响土壤微生物群落[15]。 土壤微生物能将有机质转化为腐殖质，供植物吸收利用，并改良土壤。 在春玉米种植中不同覆盖处理可以显著改变土壤微生物群落结构和多样性[16]。 春小麦种植中地膜覆盖处理可显著改变温带半干旱地区土壤真菌群落组成[17]。 已有研究显示，在盐胁迫下相较于CK，施用腐殖酸的T1、T2、T3 处理土壤真菌Ascomycota 的相对丰度分别显著提高28.07%、26.48%、6.41%[18]；与常规施肥+石灰粉处理相比，常规施肥+石灰粉+腐殖酸处理能够提高土壤细菌Bacteroidota 的相对丰度[19]。 这与本试验中覆盖FZS 地膜真菌Ascomycota 和细菌Bacteroidota 物种丰度高于覆盖PE 和MZS 地膜的结果相一致。 土壤微生物群落结构、相对丰度等的改变可能有以下原因:①在实际生产中环境因素、管理措施等都会直接或间接影响土壤微生物代谢活性；②不同地膜之间的机械性能、保湿性能、光学性能等均有较大的差异，可能会通过改变土壤理化性质、土壤温湿度进而对土壤微生物代谢活性造成一定的影响；③FZS 地膜添有腐殖酸，在其使用过程中会因膜下凝露将腐殖酸带出，而腐殖酸可以提高肥料利用率，改善土壤理化性质[20]。 以上说明不同地膜覆盖对土壤微生物相对丰度、群落结构、多样性以及土壤微生物功能基因结构组成均有一定影响。

已有研究显示，在基质中添加2.0 mg/kg 腐殖酸可以有效促进辣椒幼苗生长[21]；当椰糠∶菇渣∶草炭＝1 ∶1 ∶2时，添加4 g/L 腐殖酸番茄幼苗茎粗达到最大值[8]，这与本试验覆盖FZS 地膜可以有效促进番茄茎粗生长的结果相一致。 FZS 处理可以有效促进茎粗生长的原因可能是腐殖酸可以促进根系生长发育、增加根系数量、延长根系长度，从而促进作物对养分的吸收，达到促进作物生长的作用。

4 结论

不同地膜覆盖处理通过影响土壤微生物群落及组成进而影响土壤微生物的功能基因。 相较于覆盖PE 地膜，覆盖PBAT/PLA 腐殖酸生物降解地膜(FZS)有助于提高土壤真菌Ascomycota 和细菌Verrucomicrobiota、Bacteroidota 的物种丰度；覆盖PBAT/PLA 腐殖酸生物降解地膜(FZS)后土壤蔗糖酶活性、番茄茎粗显著高于覆盖PE 地膜。