朱砂烟和普通烤烟烟叶酚类物质差异分析

齐奎元，赵华武，金江华，张瑞平，张晓平，刘鹏飞，李玉娥

(1. 河南农业大学烟草学院/国家烟草栽培生理生化研究基地，河南郑州 450002；2. 云南中烟工业有限责任公司，云南昆明 650231；3. 吉林烟草工业有限责任公司，吉林延吉 133001)

朱砂烟是优良烟株在自然生长发育过程中发生自然变异的结果，其烟叶中烟碱大量转化为去甲基烟碱，正常调制后叶面特征显著，呈现“樱桃色”斑块。 有研究认为，红色斑块是烟叶中多酚氧化产物在降烟碱作用下产生的“樱红”色素[1]；也有学者认为朱砂烟叶上的红色物质是由去甲基烟碱和醌类物质反应而形成，其具体化学结构至今尚未确定[2，3]。 烟草中酚类物质含量是生物合成机制的结果，近年来研究表明烟叶中的酚类化合物作为烟草品质重要影响因素之一，对烟叶色泽、烟草香味和吃味有显著影响[4-9]。 烟叶酚类物质按照羟基数目的不同，可分为简单酚类和多酚。 简单酚类含量极微，而多酚含量较高。 现已发现的烟草多酚类化合物包括单宁类、香豆素类、黄酮类、花色素类、简单酚类衍生物等。 绿原酸、芸香苷和莨菪葶是烟草中多酚化合物的主要成分，约占烟草中酚类物质含量的80%以上[10]，其中绿原酸是改善烟叶等级最主要的多酚类物质[11]。

烟叶在烘烤和调制过程中，非酶促棕色化反应会影响其外观质量，调制后的干烟叶在贮存、陈化及发酵过程中，酶促棕色化反应会形成醌类聚合物类物质，使烟叶由黄色逐渐加深，变为红色、棕色以至棕褐色[12]。 曹建敏等[13]研究表明，烟叶颜色是影响烟叶多酚含量的主要因素，叶片颜色越趋于红棕色，黄酮类物质含量越低，莨菪葶含量越高。 黄酮类物质是烟草中多酚类次生代谢产物，也是影响烟草品质的重要潜香型物质[9，14]。黄酮类化合物在烟叶调制、醇化和燃烧过程中可氧化分解，赋予烟草优雅的清香气味，并增加香气量，对烟草制品品质有重要的改善作用。 成熟烟叶中黄酮体糖苷含量较高，通过裂解和降解等方式得到醇类和呋喃类等香味物质，可降低苦涩味，使吸味更加醇和[10]。 芸香苷和绿原酸在烟草生长、调制和燃烧过程中发生多种化学反应，对烟草香味有直接影响，同时芸香苷和绿原酸含量与烟叶等级有关，其在酶的作用下，易形成淡红色至黑褐色的醌类物质及其聚合物，影响烟叶颜色[15]。

目前对朱砂烟酚类物质方面的研究鲜有报道。 本研究采用福林-酚法、芦丁法、高效液相色谱法和气相色谱法分析朱砂烟和普通烟叶及其卷烟烟气中酚类物质成分，通过解析朱砂烟酚类物质成分，探索朱砂烟叶特征性红色斑块与酚类物质的相关性，分析朱砂烟与普通烤烟酚类物质之间的差异，以期为朱砂烟的选用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

材料:供试烟叶为2021 年云南省曲靖市采收的中上部烤后朱砂烟(云烟97 变异种)、普通烤烟云烟97 及朱砂烟叶上红色斑块。

试剂:甲醇为色谱纯，二氯甲烷、福林-酚试剂、苯酚、没食子酸、芦丁等其它试剂均为分析纯，均购自天津市大茂化学试剂厂。

仪器:Agilent 7890B-5977A 气相色谱质谱联用仪(Agilent Technologies 产品)；LC-20AR 高效液相色谱仪(日本岛津公司产品)；UV-5200 紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司产品)；Nicolet iS50 傅里叶变换红外光谱仪(Thermo Nicolet Co 产品)；SML 2000 直线型多通道吸烟机(中国科学院合肥物质科学院合肥众沃仪器有限公司产品)。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 总酚类物质的测定 各测定环节如下:

(1) 标准溶液和样品的制备:准确称取0.1000 g焦性没食子酸，用蒸馏水溶解并定容至1000 mL，没食子酸标准溶液浓度为100 μg/mL。准确称取6 份0.1 g 烟样(过100 目筛)，置于50 mL 锥形瓶内，分别加入50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇(分析纯)水溶液，超声萃取20 min 后静置过滤并定容至50 mL。 取1 mL 提取液使用Nicolet iS50 傅里叶变换红外光谱仪进行全波谱扫描，表明用60%甲醇(分析纯)水溶液提取的样品在340 nm 处吸光度较大，提取的酚类物质较多。 因此采用60%甲醇对样品进行提取，提取液备用。

(2)福林比色法条件考察:参照王治同等[16]的方法并进行适当修改。

10%碳酸钠溶液用量的确定:准确量取0.5 mL 没食子酸标准溶液6 份于6 支20 mL 试管中，均加入福林-酚试剂1.5 mL，待充分混合后再分别加入10%碳酸钠溶液1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 mL，之后用蒸馏水补至20 mL，混匀后避光反应，使用UV-5200 紫外分光光度计每30 min 在760 nm 处测定吸光度，以确定福林-酚试剂与碳酸钠溶液的最佳用量比。

福林-酚试剂用量的确定:准确量取0.5 mL没食子酸标准溶液5 份于5 支20 mL 试管中，分别加入福林-酚试剂1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，待充分混合后，加入10%碳酸钠溶液4.0 mL，其它条件不变，以确定福林-酚试剂用量对显色效果的影响。

反应温度及时间的确定:准确量取0.5 mL 样品溶液4 份于4 支20 mL 试管中，分别加入福林-酚试剂2.0 mL，待充分混合后，加入10%碳酸钠溶液4.0 mL，之后用蒸馏水补至20 mL，摇匀后静置，避光反应，分别于25、35、45、55℃恒温水浴锅中保温，其它条件不变，观察温度变化对显色效果的影响。

(3)标准曲线的建立:准确称取0.100 g 没食子酸粉末，用蒸馏水定容至1000 mL，得到浓度为100 μg/mL 的没食子酸标准溶液。 分别准确量取0、0.25、0.50、0.75、1.25、1.50 mL 没食子酸标准溶液于20 mL 试管中，加入福林-酚试剂2.0 mL，充分混合后再加入10% Na2CO3溶液4.0 mL，用蒸馏水定容后再25℃下避光静置30 min，以不加样品为空白，使用UV-5200 紫外分光光度计于760 nm 处测定其吸光度。

(4)样品测定:分别量取上述制备样品溶液0.5 mL，采用与“(3)标准曲线的建立”相同的方法测定样品中总酚类物质含量。

1.2.2 多酚含量的测定 取上述备用溶液2 mL，经0.22 μm 的有机相滤膜过滤至色谱瓶，用LC-20AR 高效液相色谱仪测定烤烟样品中的绿原酸、芸香苷、莨菪葶等主要多酚类物质含量。 仪器参数:A 流动相为88%超纯水、10%甲醇、2%乙酸，B 流动相为88%甲醇、10%超纯水、2%乙酸，流速为1.0 mL/min，进样量为1 μL，检测波长为340 nm。 时间程序:初始流量为15%，用3 min 升至30%，用15 min 升至60%并保持10 min，用1 min 升至100%。

1.2.3 黄酮类物质的测定 各测定环节如下:

(1)标准溶液的制备:准确称取120℃温度下干燥至恒重的芦丁标准品20.00 mg，用50%甲醇溶解并定容至100 mL，即得到浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准液。

(2)标准曲线的建立:参照陈爱洋等[17]的方法进行适当调整。 分别吸取芦丁标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于5 个25 mL 比色管中，用50%甲醇均补至6 mL，再分别加入50 g/L 亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀后静置6 min 再加入100 g/L硝酸铝溶液1 mL，摇匀后静置6 min 再加入200 g/L 氢氧化钠溶液5 mL，用蒸馏水定容后摇匀并静置15 min，以空白样为参比，使用UV-5200 紫外分光光度计在510 nm 处测定吸光度。 以吸光度为纵坐标，加入芦丁试剂相对含量为横坐标，建立标准曲线。

(3)样品测定:取样品储备液3 mL，采用上述方法测定烟叶中黄酮类物质总含量。

1.2.4 烟气中挥发性酚类物质的测定 各测定环节如下:

(1)卷烟样品制备:烟叶经人工去除主脉后切丝(宽度0.8 mm)，卷制成重量为1±0.1 g 的评吸烟支，按GB/T 16447—2004《烟草及烟草制品调节和测试的大气环境》要求调节烟支水分，每处理均制备10 支，使用SML 2000 直线型多通道吸烟机在标准吸烟条件下进行抽吸，并使用剑桥滤片收集。

(2)样品前处理:采用乙酸苯乙酯为内标标准溶液，浓度为7.945 g/L。 将剑桥滤片置于50 mL 三角锥形瓶中，加入内标标准溶液50 μL 于滤片上，然后再加入甲醇20 mL，超声萃取10 min，萃取液过0.45 μm 滤膜并定容至50 mL，移取1.5 mL 于色谱瓶中，使用Agilent 7890B-5977A 气相色谱质谱联用仪，按照工作条件进行测定。

(3)仪器条件:气相条件:进样口温度设定为250℃；载气为氦气，纯度大于99.999%，载气流速为1 mL/min；采用分流进样方式，分流比设定为10 ∶1；进样量:1 μL。 程序升温条件:初始温度100℃，保持3 min， 以8℃/min 的速率升至155℃，保持8 min，再以20℃/min 的速率升至280℃，保持8 min。

离子源温度为280℃；接口温度为280℃；四极杆温度为150℃；采用电子源轰击(EI)电子源，电离能量为70 eV；传输线温度设定为240℃；溶剂延迟设定为2 min；扫描方式为全扫描模式，扫描范围为30 ～400 amu；MS 谱库:NIST14.1；采用内标法定量。

1.2.5 感官质量评价 烟叶经人工去除主脉后切丝，卷制成重量为(1.0±0.1) g 的评吸烟支，按GB/T 16447—2004 要求调节烟支水分后进行感官质量评价。 由吉林中烟技术中心组织专家以YC/T 138—1998《烟草及烟草制品感官评价方法》为基础，按单料烟“标度值”标准统一进行感官质量评吸鉴定，并采用“九分制”标准打分。

1.3 数据处理与分析

采用Origin 2021 软件进行数据处理与作图，SPSS 19.0 软件进行统计分析，差异显著性检验采用邓肯氏法(P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同烤烟样品总酚类物质含量比较

2.1.1 检测条件筛选 由福林-酚法原理可知，碳酸钠溶液用量对多酚物质显色有一定的影响。碳酸钠溶液用量少会影响多酚物质的显色，引起试验误差[18]。 图1A 结果显示，随着10%碳酸钠溶液用量增加，吸光度呈逐渐增加趋势，加入量增至4.0 mL 时反应液的吸光度较大且稳定，再增加用量，吸光度变幅太大，且其过量下反应体系较为浑浊。 因此，10%碳酸钠溶液用量选择4.0 mL。

图1 10%碳酸钠不同用量(A)、福林-酚不同用量(B)和不同反应温度(C)对反应体系吸光值的影响

由福林-酚法原理可知，福林-酚试剂与多酚类物质在碱性条件下呈蓝色，福林-酚试剂用量会影响底物是否完全显色[19]。 由图1B 可知，福林-酚用量为2.0 mL 时，反应液显色较为稳定且反应体系清澈、无碳酸钠结晶，再增加用量虽然吸光度增大但不稳定。 因此，福林-酚试剂用量选择2.0 mL。

由图1C 可知，当温度为25℃时，吸光度较大，随着温度的升高，吸光度逐渐下降。 因此反应温度选择25℃。

综上，确定优化反应条件为:样品溶液0.5 mL，加入福林-酚试剂2.0 mL，充分混合后再加入10%碳酸钠溶液4.0 mL，并用蒸馏水定容至20 mL，于25℃下避光放置40 min，之后在760 nm 处检测样品的吸光度。 按该方法测定部分样品并反应30～40 min 时吸光度较稳定，因此确定用此方法。

2.1.2 总酚类物质含量比较 由表1 可见，同部位烤烟样品总酚类物质含量均存在显著差异，上部叶总酚类物质含量均高于中部叶。 云烟97 上、中部叶总酚类物质含量均较低，朱砂烟处于中等水平，朱砂烟中红色斑块含量最高，且显著高于云烟97 和朱砂烟。

表1 不同烤烟样品总酚类物质含量

2.2 不同烤烟样品主要多酚类物质含量比较

由表2 可知，不同部位烟叶之间主要多酚类物质含量差异较大，上部叶含量较高。 红色斑块总量处于最高水平，中、上部朱砂烟叶和红色斑块主要多酚类物质总量分别高出云烟9718.71%、22.76%和31.82%、41.95%。

表2 不同烤烟样品主要多酚类物质含量 (mg/g)

就中部叶而言，绿原酸和芸香苷含量各烟样间差异均显著，云烟97 绿原酸含量最低，红色斑块含量最高。 云烟97 与朱砂烟比较，莨菪葶含量差异不显著，朱砂烟含量略高；红色斑块莨菪葶含量显著高于云烟97 和朱砂烟。

上部烟叶中，云烟97、朱砂烟和红色斑块的绿原酸含量差异显著，红色斑块绿原酸含量显著高于朱砂烟和云烟97，云烟97 含量最低。 红色斑块莨菪葶含量最高，显著高于云烟97 和朱砂烟，云烟97 莨菪葶含量最低，但与朱砂烟不存在显著差异。 红色斑块芸香苷含量最高，与云烟97差异显著，朱砂烟与云烟97、红色斑块间均差异不显著。

2.3 不同烤烟样品黄酮类物质总量比较

通过全光谱扫描，确定黄酮类物质的反应体系在510 nm 处吸光度最大，因此使用紫外分光光度计检测此处样品中的黄酮类物质含量。 以芦丁为标准品建立标准曲线:y ＝12x+0.0046，R2＝0.9992。由表3 可知，同部位烟叶之间黄酮类物质总量存在显著性差异，且云烟97 含量均最低。 中部烟样中，相比于云烟97，红色斑块黄酮类物质总量高出9.07%，朱砂烟含量显著低于红色斑块。上部烟样中，云烟97 黄酮类物质总量最低，朱砂烟和红色斑块含量比云烟97 分别高出6.45%、10.37%，红色斑块黄酮类物质总量处于最高水平。

表3 不同烤烟样品黄酮类物质总量(mg/g)

2.4 不同烤烟样品烟气中挥发性酚类物质含量比较

酚类化合物是卷烟主流烟气的主要组分之一，与卷烟的安全性和感官品质密切相关。 由表4 可知，同部位不同烤烟烟气中挥发性酚类物质总量差异较大，上部叶明显高于中部叶，朱砂烟上部叶该类总量最大，且其各酚类物质含量大多高于云烟97。 朱砂烟卷烟样品烟气中的苯酚、对苯二酚含量较高。

表4 不同烤烟样品烟气中挥发性酚类物质含量(μg/g)

2.5 不同烤烟样品卷烟感官质量评价

由表5 可知，朱砂烟中、上部烟叶各感官质量评价指标均优于云烟97，其香气质和香气量较好，余味舒适，刺激性稍有，劲头较低，燃烧性中等，灰分灰白，杂气较轻。 同部位同等级烟叶中，朱砂烟叶感官质量综合评分较高。

表5 不同烤烟样品卷烟感官质量评价结果(分)

3 讨论

3.1 福林-酚法优化

酚类物质结构上含有酚羟基，呈酸性或弱酸性，不溶于水，而碳酸钠溶液呈弱碱性，因此需要控制碳酸钠溶液用量及浓度，既能使其充分反应，又可以避免反应体系的不平衡；碳酸钠溶液受温度影响较大，温度较低时会析出结晶、引起试验误差；多酚类物质受热易分解，会导致测定结果偏低，因此要控制合适的温度；显色30 ～40 min 时，吸光度均已达到稳定。 通过对10%碳酸钠溶液用量、福林-酚用量、反应温度和反应时间的探索优化，确定福林-酚法测定条件的最优组合为:10%碳酸钠溶液用量4.0 mL、福林-酚用量2.0 mL、反应温度25℃、显色时间40 min，这样总酚的测定结果更加准确。

3.2 朱砂烟和普通烤烟酚类物质含量差异分析

本研究结果表明，不同烤烟样品之间总酚类物质含量存在显著性差异；同部位烤烟中，朱砂烟叶上红色斑块处总酚类物质含量最高，云烟97 略低于朱砂烟。

不同烤烟样品间中部叶烤烟主要多酚类物质含量差异较大，绿原酸、芸香苷含量均差异显著。整体上朱砂烟叶主要多酚类物质含量相对较高，尤其是朱砂烟叶上红色斑块处。 烟叶调制过程中，酚类物质发生酶促和非酶促反应形成分子量较大的黄色、红色以至棕褐色色素，影响烟叶的色泽[20]，这与朱砂烟独特的色泽有极大关系。

上部叶烤烟中，不同烤烟样品间绿原酸含量均有显著性差异。 绿原酸是改善烟叶品质最主要的多酚类物质[10]。 朱砂烟与云烟97 的芸香苷和莨菪葶含量不存在显著性差异，与红色斑块的芸香苷含量也没有显著性差异，与其莨菪葶含量相比显著减少。

黄酮类物质为烤烟香气的前体物质之一[9]。本研究表明，不同烤烟样品黄酮类物质含量存在显著性差异；同部位烤烟样品中朱砂烟叶黄酮类化合物含量较高，显著高于云烟97，显著低于红色斑块。

朱砂烟叶特征性红色斑块的黄酮类物质含量和酚类物质含量最高，其形成原因可能是烟叶中酚类物质氧化成醌类或其它呈红色的物质，也可能是黄酮类物质在氧化或调制、纯化过程中形成的某种物质。

3.3 不同烤烟样品烟气中挥发性酚类物质含量差异分析

烟叶中酚类物质在卷烟抽吸时直接进入烟气的量很少，烟气中酚类物质主要来源于烟叶中多酚类物质的裂解；卷烟制品抽吸时会发生酸性反应，中和部分碱性，使吃味醇和，对卷烟制品的抽吸品质起着重要作用[21]，如2，6-二甲基苯酚具有增甜和增香的效果，苯酚具有甜味和药物气味。本试验通过GC-MS 对烟草制品进行分析，结果显示，同部位卷烟样品中，朱砂烟的挥发性酚类物质总量较高。 挥发性酚类物质大都具有酚香气，一些简单酚对烟气香吃味产生愉快的影响，其中苯酚、乙基酚、对乙烯基愈创木酚、2，5-二叔丁基苯酚对卷烟香气和吃味有较好影响，而朱砂烟中这些挥发性酚类物质含量均较高，这将赋予朱砂烟独特的香气质、充足的香气量和较好的吃味。

3.4 烤烟样品感官质量分析

烤烟感官质量与酚类物质相关，酚类物质在卷烟燃烧时，通过热裂解、中和等反应，使吃味更加醇和。 有研究表明，多酚类物质尤其是绿原酸，是改善烟草吸食品质的重要因素之一，与香气质和香气量呈显著正相关[22，23]。 朱砂烟叶中酚类物质尤其是绿原酸含量较高，赋予其丰满的香气质和充足的香气量。 焦天雷等[24]研究表明，相比于普通烤烟，香气物质含量高可能是朱砂烟风味特征的物质基础。 对烟草制品进行感官质量评价表明，朱砂烟叶整体质量较高，其卷烟香气质较好、香气量较足、吃味更加醇和，这与前人研究结果具有较高的一致性[25]。

4 结论

本研究确定的福林-酚法测定烟叶总酚含量的最优条件为:样品用量0.5 mL，福林-酚试剂用量2.0 mL，充分混合后再加入10%碳酸钠溶液4.0 mL，25℃下避光放置40 min，之后在760 nm 波长下测定样品中总酚类物质含量。 朱砂烟总酚类物质、主要多酚类物质和黄酮类物质含量较高，且与云烟97 普通烟叶之间大多差异显著，品质较高。不同烤烟样品卷烟的挥发性酚类物质含量差异较大，朱砂烟各挥发性酚类物质含量较高，具有较好的香气质和吃味，香气量较足。 整体上看，朱砂烟较优。