不同成熟度雪茄烟叶的抗氧化特性及其品质分析

管庆林，康家豪，睢雅琳，陶玉娇，秦艳青，雷云康，王俊，赵铭钦

(1. 河南农业大学烟草学院/国家烟草栽培生理生化研究基地，河南郑州 450002；2. 中国烟草总公司四川省公司，四川成都 610041；3. 四川省烟草公司德阳市公司，四川德阳 618400)

成熟度是影响烟叶品质的关键因素，雪茄烟由于其晾制周期较长，成熟度对烟叶品质的影响更为突出[1，2]。 烟叶成熟过程中，植株体内抗氧化系统，如过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性及还原型谷胱甘肽(GSH)、木质素等抗氧化物质含量降低，膜脂发生过氧化，细胞膜受到损伤，甚至导致细胞死亡[3，4]。 种子中活性氧(ROS)清除体系主要包括酶促和非酶促抗氧化系统。 酶促抗氧化系统主要由过氧化氢酶、过氧化物酶及丙二醛组成，非酶促抗氧化系统主要由苯丙氨酸解氨酶、还原型谷胱甘肽及木质素组成[5]。 当植物体内活性氧水平上升时，过氧化物酶及过氧化氢酶活性随之升高，植物对活性氧的清除能力增强，进而提升植物品质[6]。 车燕萍[7]研究认为，外施GSH 和OTC(L-2-噻唑林二酮-4-甲酸，GSH 合成促进剂)，导致TMV 诱导的ROS 积累减少，丙二醛(MDA)含量降低。 酚类物质和木质素含量与其过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性及非酶促抗氧化能力密切相关[8]。 卢绍浩等[9]研究认为，雪茄烟叶晾制期间合理调控温度，烟叶PAL 活性较高，有利于提高烟叶的抗氧化能力。 宋瑞芳等[10]研究认为，植物受到病原体感染后PAL 活性升高，且PAL 活性的升高与木质素的产生和积累呈正相关。

目前，有关不同成熟度条件下烤烟叶片膜脂过氧化特性研究已有许多[11-13]。 而成熟度对雪茄烟叶抗氧化特性与品质效应影响的研究尚未见到报道。 本试验以雪茄烟品种德雪3 号、德雪5号为材料设置不同成熟度处理，并以四川德阳当地常规采收成熟度为对照，研究各成熟度处理对雪茄烟叶抗氧化特性及其品质的影响，旨在为四川优质雪茄烟原料生产中最适成熟度选取提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020 年在四川省什邡市洛阳村进行。供试雪茄烟品种为德雪3 号、德雪5 号。 试验田土壤为水稻土，有机质含量为3.0 g/kg、碱解氮120 mg/kg、速效磷38.1 mg/kg、速效钾89 mg/kg，pH 值为6.3。

1.2 试验设计与田间管理

采用单因子完全随机试验设计，设3 个处理(M1、M3 和M4)和对照(M2，当地常规采收成熟标准)，重复3 次。 参考赵松超等[14]制定的成熟度标准(表1)实施处理。 选取中部叶(自下而上第10～12 叶位)取样并液氮冷冻保存，用于抗氧化特性指标测定。

表1 试验设计及样叶外观特征描述

4 月30 日移栽，行距120 cm，株距40 cm。烟田施氮(N)180 kg/hm2(烟草专用复合肥)，N ∶P2O5∶K2O＝1∶0.5∶3，分别于起垄整地时条施和移栽后30 d 追施，肥料基追比为7∶3。 其它田间农事操作与管理均按照当地优质雪茄烟叶生产技术规范统一进行。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 抗氧化特性相关指标测定 采用愈创木酚法测定POD 活性[15]，分光光度计法测定CAT活性[16]和PAL 活性[17]，双组分分光光度计法测定MDA 含量[15]， 酶循环法测定GSH 含量[18]，采用NaOH/尿素低温溶解法[19]测定木质素含量。

1.3.2 干物质相关指标测定 每处理选取3 株长势均匀一致植株的中部叶做好记录。 叶片采收后于105℃下杀青15 min，再65℃烘干至恒重称干重，重复3 次，取平均值。

1.3.3 常规化学成分测定 取各处理晾制后烟叶，烘干磨碎过60 目筛。 准确称取0.25 g 烟样于50 mL 小白瓶中，瓶内加5%醋酸溶液25 mL，振荡30 min 后过滤，之后采用流动分析法测其常规化学成分含量[20]。

1.3.4 感官质量评价 堆垛发酵后烟叶，经回潮、卷制和烟支养护等工序后制成雪茄烟待评吸标准样品，由国家烟草栽培生理生化研究基地与四川省烟草公司德阳市公司共同邀请四川、湖北、安徽、山东、浙江、河南等省工业公司以及上烟集团有关专家组成烟叶质量评吸委员会对其进行评析评价。 评价指标包括属性特征、香韵、劲头、浓度、香气质、香气量、余味、杂气、刺激性、甜度、灰色共11 项指标，各指标均取算术平均值，即为各样品各指标的得分。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2016 进行数据整理及作图，运用DPS 7.05 软件进行显著性分析(P＜0.05)及抗氧化特性指标与干物质含量的简单相关分析，采用Duncan’s 法进行处理间多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同成熟度对雪茄烟叶酶促抗氧化特性的影响

由图1A 可知，2 个雪茄品种烟叶CAT 活性随成熟度增加均呈现先升高后降低的变化趋势，均在M3 时最高，之后下降，至M4 阶段降幅分别达39.3%和31.0%。 2 个品种叶片成熟度在M1到M3 之间保持较高的CAT 活性，之后德雪3 号急速下降，德雪5 号下降略缓。 不同成熟度条件下品种间的CAT 活性差异较大，M1、M2 时德雪5号高于德雪3 号，M3、M4 时德雪3 号高于德雪5号。

图1 不同成熟度对雪茄烟叶CAT、POD 活性及MDA 含量的影响

从图1B 看出，2 个品种烟叶POD 活性随成熟度增加均呈先缓慢升高后快速降低的趋势，即在M3 达到峰值后开始下降，至M4 时分别降低39.33%和44.92%。 烟叶成熟衰老过程中，德雪5号烟叶POD 活性总体上均高于德雪3 号，二者间差异在M2 时达到最大。

丙二醛含量可以表征烟叶细胞膜脂过氧化水平[21]。 由图1C 可知，随着烟叶成熟进程的延伸，烟叶MDA 含量呈现先升高后降低趋势，峰值出现在M2。 不同成熟度之间比较，2 个品种烟叶MDA 含量均表现为M2＞M1＞M3＞M4。

2.2 不同成熟度对雪茄烟叶非酶促抗氧化特性的影响

由图2A 可以看出，随着雪茄烟叶成熟进程延伸，烟叶GSH 含量呈先降低后上升即“V”形变化趋势，其低谷值出现在尚熟(M2)即生理成熟阶段。 2 个品种虽然GSH 含量在不同成熟条件下存在一定差异，但总的变化趋势一致，说明当烟叶处在尚熟阶段时，GSH 正与相关酶共同进行抑制脂质过氧化或终止脂质过氧化反应[22]，GSH 大量被消耗，抗氧化能力逐渐增强。

图2 不同成熟度对雪茄烟叶GSH 含量、PAL 活性及木质素含量的影响

PAL 活性高低控制着植物体内多种次生酚类化合物、类黄酮植保素、木质素等抗菌物质的合成[23]。 从图2B 可知，随着烟叶成熟度增加，2 个品种烟叶PAL 活性均呈先上升后下降的变化趋势，其峰值出现在尚熟(M2)时期。 这一结果正好与GSH 变化趋势相反，说明尚熟阶段是烟叶抗氧化最为激烈的时期。

木质素是植物中常见的非酶促抗氧化活性物质，可有效抵御微生物侵袭，提高植物的非酶促抗氧化能力[24]。 由图2C 可知，随着成熟度增加，烟叶木质素含量从欠熟(M1)到适熟(M3)阶段缓慢增加，适熟(M3)时达到高峰，之后开始急剧下降，过熟(M4)时含量最低。 说明烟叶过熟阶段木质素分解速率大于积累速率，烟叶非酶促抗氧能力减弱。

2.3 不同成熟度对雪茄烟叶干鲜比的影响

烟叶干鲜比值是表征植物进行有机物积累的重要指标，对指导优质雪茄烟叶生产起着重要作用[25]。 由图3 可以看出，随着烟叶成熟度增加，2个品种的叶干鲜比均在适熟(M3)期之前逐渐上升，之后则明显下降。 成熟时期不同，2 个品种干物质积累速率也有所不同，适熟(M3)阶段德雪3号烟叶干鲜比高于德雪5 号，其它成熟阶段德雪5 号烟叶干鲜比又高于德雪3 号。 表明不同成熟阶段品种间烟叶干鲜比存在明显差异，进而反映了烟叶生物积累量的差异。

图3 不同成熟度对雪茄烟叶干鲜比的影响

2.4 雪茄烟叶抗氧化特性指标间及其与干物质积累指标间的相关性分析

由表2 可知，烟叶干鲜比与大多数抗氧化特性指标呈显著或极显著性相关。 PAL 活性与POD 活性、MDA 含量、木质素含量、干鲜比均呈极显著正相关，与GSH 含量呈极显著负相关，与CAT 活性相关不显著。 这说明PAL 对烟叶抗氧化系统及干物质积累有重要影响，即烟株在遭受活性氧侵害时，苯丙烷类代谢被激活，PAL 活性上升，抗氧化能力增强，干物质积累加快。

表2 烟叶抗氧化特性指标间及其与干物质积累指标间的相关性

GSH 含量与木质素含量呈极显著负相关，与MDA 含量、叶干鲜比均呈显著负相关，与CAT、POD 活性间的负相关未达到显著水平。 这表明GSH 含量可以表征细胞非酶促抗氧化能力、膜脂过氧化水平及烟叶干物质含量积累。 MDA 含量与POD 活性、木质素含量均呈极显著正相关，表明细胞膜脂过氧化水平与非酶促抗氧化途径间存在协同作用。 POD 活性、CAT 活性、木质素含量与叶干鲜比呈极显著正相关，表明烟叶干物质积累与酶促、非酶促抗氧化特性指标间存在较强的相关性。

2.5 不同成熟度对雪茄烟叶常规化学成分含量的影响

由表3 可知，德雪3 号和德雪5 号烟叶总糖、还原糖含量随着成熟度增加呈先增加后降低趋势，最大值均出现在适熟(M3)阶段。 2 个品种烟叶烟碱含量随成熟度增加而增加，过熟(M4)时达到最大值，总氮、钾含量则均随成熟度增加而降低，欠熟(M1)时最高。 烟叶氯含量呈先降低后增加趋势。

表3 不同成熟度对雪茄烟叶常规化学成分含量的影响

化学成分比值是评价烟叶内在化学成分协调性的重要指标。 2 个品种烟叶氮碱比均随成熟度增加而持续降低，钾氯比呈先升后降的单峰变化趋势。 糖碱比与钾氯比的变化趋势较为一致，其中德雪3 号适熟(M3)时最高，德雪5 号尚熟(M2)时最高。

综合来看，适熟(M3)时采收，2 个品种烟叶常规化学成分含量及其比值较为协调，烟叶品质最优。

2.6 不同成熟度对烟叶感官质量的影响

由表4 可知，随着成熟度的提高，烟叶感官评吸质量均呈先上升后下降的变化趋势，质量得分峰值处在适熟(M3)阶段。 但不同质量指标随烟叶成熟度的变化而变化的规律性明显不同，其中，适熟烟叶香气质最好，香气量大，劲头足，余味干净舒适，回甜感强。 处理间比较，总体质量以适熟(M3)烟叶最佳，尚熟(M2)、过熟(M4)烟叶次之，欠熟(M1)最差。

表4 不同成熟度对雪茄烟叶感官质量的影响

3 讨论与结论

烟叶成熟是CAT、POD 等抗氧化系统关键酶活性功能下降、活性氧积累及膜脂过氧化作用不断加强的过程[26]。 本研究表明，2 个雪茄烟品种适熟(M3)时采收的烟叶能够保持较强的抗氧化活力、细胞生理代谢活动正常，过熟(M4)时烟叶抗氧化能力明显下降，细胞膜系统严重受损，甚至死亡。 这与王宁等[27]的研究结果相一致。

还原型谷胱甘肽(GSH)含量过高会导致其在机体内过量积累，引起氧化损伤，对机体产生毒性作用[28]。 木质素的合成与PAL 活性的增加呈正相关，细胞中的PAL 活性在木质化之前迅速上升，而细胞壁的PAL 活性在木质化期间快速增加[29]。 本研究发现，无论是德雪3 号还是德雪5号，从尚熟(M2)到适熟(M3)阶段，烟叶PAL 活性下降，GSH、木质素含量增加。 这说明适熟(M3)阶段是烟叶生理功能走向衰老的关键时期，也是抗氧化能力最高水平时期[11]。 过熟(M4)烟叶表现为GSH 含量上升，PAL 活性及木质素含量快速下降，表明烟叶机体自身氧化与抗氧化的动态平衡被打破，膜结构和功能受到伤害。 这与Ueno 等[30]的研究结果相吻合。

干物质积累作为直接影响烟叶产量的指标，其含量受烟叶成熟度影响较大。 成熟期是烟叶进行碳氮代谢和干物质积累的关键时期，对烟叶产量、质量有重要影响[31]。 本研究表明，由欠熟(M1)到适熟(M3)阶段，烟叶干物质积累速率明显加快，之后快速下降。 这说明随着烟叶逐渐成熟衰老，烟叶叶绿体肿胀、类囊体解体，光合能力下降，进而干物质积累速率和生物量降低。 这与阚洪赢[32]的研究结果相似，表明适时采收有利于干物质积累和产量质量的形成。

常规化学成分是衡量烟叶内在质量的核心内容，其含量高低随烟叶成熟度的变化而随之发生变化。 一般认为，优质雪茄烟叶常规化学成分适宜范围为总糖2%左右、总氮4%～6%、烟碱2.8%～3.8%、钾≥2%、氯0.3%～0.6%、钾氯比≥6[33]。本研究结果显示，雪茄烟叶总糖、还原糖含量以适熟(M3)期含量最高。 其原因可能是生理成熟期(M2)到适熟采收期(M3)，烟叶的光合作用相对较强且碳水化合物如淀粉、总糖等物质积累最多，而到过熟(M4)阶段烟叶淀粉等大分子物质又发生降解而产生小分子物质，糖类物质积累下降，这与尹启生等[34]研究结果相一致。 本试验中，德雪3 号和德雪5 号烟叶总糖和还原糖含量普遍偏低，这一方面可能是由于雪茄烟叶调制过程较长，糖类物质损耗较多，另一方面可能与四川省雪茄烟打顶时期较早、种植密度过高有关[35]。 烟碱是雪茄烟的特色成分和重要质量特征指标，在德雪3 号和德雪5 号烟叶中随成熟度增加而增多，但均低于2.8%，可能与烟碱自身发生降解、转化有关[36]。 烟叶钾含量在成熟过程中一直呈下降趋势，其原因可能是随着成熟度增加，钾离子向其它部位运输、损失较大，因而造成烟叶钾离子含量较低[37]。 烟叶氯离子含量随着成熟度增加呈先下降再上升的变化趋势，总氮含量则随成熟度增加而下降。 这与赵铭钦等[38]的研究结果相吻合。

感官质量是评价烟叶质量的关键指标。 本研究表明，随着成熟度增加，烟叶从M1 到M3 阶段，其感官质量持续提高，到过熟(M4)阶段烟叶质量明显变差。 表明适熟期烟叶发育充分，干物质积累处于高峰，香气物质分解、转化充分，烟叶质量特征得到充分体现，风格特征得到充分彰显。

综上所述，随着烟叶成熟进程的延伸和后期衰老程度的加剧，活性氧(ROS)清除酶的活性、能力下降，叶片逐渐走向衰老。 从欠熟(M1)到适熟(M3)阶段，烟叶CAT 和POD 活性较高，膜脂过氧化水平较低，且PAL 活性和木质素含量均较高，干物质积累速率加快，调制后烟叶的常规化学成分含量平衡、协调，感官质量逐渐升高。 从适熟(M3)到过熟(M4)阶段，烟叶的抗氧化能力急剧下降，膜系统有关的代谢活动紊乱，光合作用受阻，物质转化趋向于以氧化分解为主，向着烟叶质量变差的方向发展。 较当地常规成熟(M2)期采收，德雪3 号、德雪5 号雪茄烟叶适熟(M3)期采收，有利于烟叶抗氧化特性提升和烟叶品质提高。