咖啡产香酵母的分离鉴定及其挥发性成分分析

徐心悦，赵桐桦，万丽琼，罗麟霜，索玉凯*，何飞飞

1. 云南民族大学民族医药学院民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室（昆明 650000）；2. 云南大学资源植物研究院·农学院（昆明 650000）

咖啡豆是茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea）植物的种子，其经过烘焙后具有特殊的香气[1]。云南是我国最大的咖啡生产区，主要种植品种为小粒咖啡（Coffea arabicaLinn.）[2]。咖啡初加工是指由咖啡鲜果制成咖啡生豆的过程，其意义在于借助微生物和咖啡中酶的作用，将咖啡内的糖类物质转化为醇类、酸类和酮类等芳香物质，从而使咖啡豆呈现不同风味，是形成商品豆的重要环节[3-4]。

近年来，微生物发酵对咖啡风味的影响及咖啡专用发酵剂的开发成为咖啡产业的研究热点。Wang等[5]研究表明添加葡萄糖调控乳酸乳球菌亚种（Lactococcuslactissubsp.cremoris）发酵咖啡生豆，可以显著提高咖啡的风味品质。云南咖啡与精品咖啡豆相比，存在花果香风味不足的问题[6]。因此，开发增强咖啡花果风味的微生物发酵剂，对于提升云南咖啡的风味品质十分必要。

酵母菌作为兼性厌氧微生物，在咖啡的自然发酵过程中起着重要作用[7]。我国研究者利用外源酿酒酵母发酵改善咖啡风味，并取得一定进展[6,8]，但对于云南小粒咖啡自然发酵过程中的产香酵母尚缺乏系统挖掘。试验从云南主要咖啡产区（保山、普洱、德宏和临沧）的咖啡鲜果和发酵过程中筛选产香酵母，并利用气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其主要代谢产物，从而为小粒咖啡专用发酵剂的开发奠定前期基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料

小粒咖啡鲜果采自保山、普洱、德宏和临沧的咖啡庄园；采摘的同一批次咖啡豆分别进行湿法处理和半干法处理，并在处理末期取样。

1.1.2 培养基

YPD培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，固体培养基添加琼脂20 g/L。发酵培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，果糖16.1 g/L，半乳糖0.1 g/L，甘露糖0.3 g/L，葡萄糖8.5 g/L。

1.1.3 试验试剂

蛋白胨、酵母粉（OXOID）；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖（上海源叶生物科技有限公司）；二氯甲烷、乙酸乙酯（天津市致远化学试剂有限公司）；其余试剂均为分析纯。

1.1.4 试验仪器

752N紫外可见分光光度计（上海昂拉仪器有限公司）；THZ-98AB恒温振荡器（上海一恒科技有限公司）；TP600PCR仪（TaKaRa）；D-37520小型台式离心机（德国Sigma公司）；RE-2000A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；YXQ-50S11立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）；AgilengtGCMS7890B 5977A MSD气相色谱/质谱分析联用仪（Agilent Technologies）。

1.2 试验方法

1.2.1 咖啡内生酵母的分离纯化

咖啡鲜果经蒸馏水冲洗后，经75%乙醇漂洗5 min，经无菌水洗涤3次，并在0.1%的次氯酸钠中浸泡10 min，再用无菌水冲洗3次。处理好的咖啡果切开后，将果皮、果肉和咖啡豆分别置于YPD培养基平板，在28 ℃条件下培养2～4 d，待样品边缘处长出菌落。挑取菌落进行划线培养，从而获得酵母菌株，并将其保存至-80 ℃冰箱备用。

1.2.2 咖啡湿法发酵和半干法发酵中酵母的分离

在咖啡豆湿法发酵和半干法发酵末期分别取样，并将样品保存于4 ℃备用。在无菌条件下，对咖啡湿法发酵液进行梯度稀释（10-1～10-7）。对于半干法处理的样品，取2 g咖啡豆加入10 mL无菌水中，振荡混匀5 min，将上清液进行梯度稀释（10-1～10-5）。随后，将稀释液分别涂布于YPD培养基平板，在28 ℃条件下培养2～4 d，待平板上长出菌落，将其进行划线培养分离。

1.2.3 产香酵母的鉴定与筛选

提取分离菌株的基因组DNA，并使用引物（上游：5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’；下游：5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’）扩增5.8S rRNA部分序列。基于测序结果，采用MEGA6.0软件构建系统进化树，从而进行分子鉴定。将酵母菌株在YPD液体培养基中活化后，以1%（V/V）接种量转接至发酵培养基，在28 ℃，150 r/min培养36 h，筛选能够产香气的菌株。

1.2.4 挥发性成分的提取

产香酵母以1%（V/V）接种量转接至发酵培养基，在28 ℃，150 r/min条件下培养36 h，离心取上清液，加入等体积的乙酸乙酯溶液，充分混匀后对其超声处理（1 h）。静置待其分层，吸取上层溶液，加入无水硫酸钠，静置4 h过滤得澄清溶液，脱水干燥后加入二氯甲烷复溶，用于GC-MS分析。

1.2.5 GC-MS分析

气相色谱条件：色谱柱为Agilent VF-WAXms（30m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氦气，流量为1.5 mL/min；起始温度50 ℃保持1 min，以6 ℃/min速率上升到150 ℃，保持2 min，以5 ℃/min速率上升到250℃，保持7 min。进样口温度250 ℃，分流比10∶1；进样体积1 μL。

质谱条件：EI方式，气质接口温度280 ℃，离子源温度30 ℃，离子化电压70 eV，扫描范围35～500 amu，扫描速率1.65 scan/s，溶剂延迟4 min。

图谱检索：通过谱库（NIST05，Wiley275）对所得挥发性成分进行定性，用色谱峰面积归一化法对各挥发性成分进行定量。

2 结果与分析

2.1 产香酵母的分离鉴定

在菌株分离纯化过程中，主要挑选呈现酵母菌落特性（质地均匀、表面湿润、黏稠、易挑起、较细菌菌落大而厚、乳白色），且培养时散发酵母香气的菌落。经分子生物学鉴定，从咖啡鲜果、咖啡湿法处理和半干法处理中共筛选到76株酵母，主要为毕赤克鲁维酵母（Pichiakluyveri）、异常毕赤酵母（P.anomala）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniasporauvarum）、矮小假丝酵母（Kazachstaniahumilis）和德尔布有孢圆酵母（Torulasporadelbrueckii）。其中，3株酵母的发酵液呈现出浓郁的花果香味，命名为Y03，Y09和Y24。将3株菌的5.8S rRNA序列与NCBI数据库中的序列进行同源比对，并利用NeighborJoin法构建系统发育进化树。结果表明，Y03，Y09和Y24分别与K.humilisCh1、K.humilisYMX000387和H.uvarumPMM09-2765L聚于同一个分支，同源性都在99%以上（图1），初步判定Y03和Y09为K.humilis，Y24为H.uvarum。

图1 酵母菌株基于5.8S rRNA序列进化树

2.2 酵母发酵液挥发性成分总离子图谱分析

咖啡果肉中的糖类成分主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖组成，为评估3株酵母以咖啡果肉为底物进行发酵时所产的挥发性物质，模拟咖啡果肉的糖组成进行后续发酵。3株酵母发酵液挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图见图2，得到的谱图与NIST05，Wiley275谱库检索及对比分析，用色谱峰面积归一化法对各挥发性成分进行定量，鉴定出的挥发性成分和相对含量见表1。

表1 3种不同酵母发酵的发酵液挥发性成分

图2 菌株发酵液挥发性成分总离子流图

2.3 不同酵母发酵的发酵液挥发性成分定性定量分析

利用数据库检索及数据分析，对3株酵母发酵液的挥发性成分进行定性定量。由图2和表1可知：Y03菌株发酵液经过GC-MS分析，能检测到的挥发性成分主要有40种，包括醇类（40.25%）、肽类（22.12%）、酮类（11.97%）、含硫化合物（9.60%）、酯类（8.76%）、其他化合物（2.84%）、糖类（2.07%）、胺类（1.09%）、酚类（0.83%）、杂环类（0.29%）、烷烃类（0.1%）、酸类（0.08%）；相对含量较高的物质为苯乙醇、2, 3-二氢-3, 5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、对羟基苯乙醇、苯乙酸，4-十四酯、乙酸苯乙酯、呋喃酮、异戊酸香叶酯，分别占35.65%，4.38%，4.26%，2.01%，1.17%，0.69%和0.61%。Y09菌株发酵液能检测到的挥发性成分主要有35种，包括醇类（38.89%）、肽类（18.47%）、酮类（11.13%）、胺类（10.48%）、酯类（8.67%）、其他化合物（4.00%）、醚类（2.49%）、糖类（1.58%）、吡喃（1.23%）、烷烃类（1.05%）、苯（0.98%）、酚类（0.86%）、醛类（0.17%）；相对含量较高的物质为苯乙醇、六氢吡咯并[1, 2-A]吡嗪-1, 4-二酮、对羟基苯乙醇、苯乙酸，4-十四酯、2, 3-二氢-3, 5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、邻苯二甲酸二丁酯、乙酸苯乙酯，分别占30.56%，7.07%，4.72%，2.51%，2.10%，1.36%和1.29%。Y24菌株发酵液能检测到的挥发性成分主要有31种，包括醇类（29.63%）、肽类（28.63%）、酮类（18.17%）、胺类（10.67%）、酯类（3.33%）、其他化合物（2.49%）、醚类（2.27%）、糖类（2.09%）、吡喃（1.12%）、烷烃类（0.70%）、苯（0.60%）、酚类（0.29%）；相对含量较高的物质为苯乙醇、六氢-3-（苯基甲基）吡咯并[1, 2-A]吡嗪-1, 4-二酮、六氢吡咯并[1, 2-A]吡嗪-1, 4-二酮、2, 3-二氢-3, 5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、对羟基苯乙醇、邻苯二甲酸二丁酯，分别占14.05%，13.30%，9.96%，3.43%，2.26%和1.86%。因此，3株酵母经发酵后可以产生大量的醇类、酯类和酮类等挥发性物质。

3 讨论

为筛选云南小粒咖啡原生产香酵母，试验对咖啡鲜果、咖啡湿法处理和半干法处理中的酵母进行分离纯化，发酵试验表明菌株Y03，Y09和Y24可以产生浓郁的花果香气。GC-MS分析结果表明，3株酵母在发酵中可以产生醇类、酯类、酮类和酸类等芳香类物质。酯类化合物大多都具有水果和花香味道，它们的来源主要由脂肪酸和醇类化合物的酯化反应，并且微生物在细胞内可以通过代谢合成酯类化合物，一般是使用高级醇，在乙酰转移酶作用下合成[9]。酮类化合物大部分都具令人愉快的气味，在挥发性物质组成上占有重要地位。醇类化合物和水都是极性分子，这些分子都具有羟基这个极性基团，因为氢键的作用力会将醇和水分子的排列方式一步一步理顺，进而加强醇类化合物的水分子束缚力，降低了醇分子的活度，在味道的感觉上显现为圆润柔和，可与香味成分共同协调[10]。进一步分析3株酵母的挥发性成分发现，苯乙醇是玫瑰香气的无色液体，在我国可当作食用香料使用[11]；异戊酸香叶酯为无色至微黄色液体，带有浓郁苹果、菠萝的果味香气，并且有玫瑰香；乙酸苯乙酯是无色的油性透明液体，具有玫瑰香气和蜂蜜香气，在食品工业中可以用作食用香料[12]；异戊酸是无色黏稠状液体，稀释后具有甜的果香，并且还有笃斯越橘的香味，是我国规定可以使用的食用香料[13]；2, 3-二氢-3, 5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮属于吡喃烯醇酮类化合物，这类具有环状烯醇酮类的化合物大多具有焦糖样香味，在味觉上呈现出的“甜味”更加突出[14]。上述化合物不仅有特殊的香气，其在发酵液中含量也相对较高。因此，筛选出的咖啡原生酵母菌可以产生花果香味物质，在强化云南小粒品质方面有着较大的应用潜力。

4 结论

从咖啡鲜果、咖啡湿法处理和半干法处理中共筛选到76株酵母，其中3株酵母在发酵中产香浓郁。随后的分子鉴定表明，Y03和Y09菌株为K.humilis，Y24菌株为H.uvarum。GC-MS分析结果表明，3株酵母在发酵过程中可以产生苯乙醇、乙酸苯乙酯、异戊酸等具有花果香气的醇类、酯类、酸类和酮类物质，下一步可用于云南咖啡发酵，从而弥补小粒咖啡花果香不足的缺陷。