基于高通量基因测序分析火锅蘸料原料微生物多样性

张隋鑫，陈腊梅，王宇，杨瑞香，萨如拉，纪晓梅

内蒙古草原红太阳食品股份有限公司（呼和浩特 010000）

火锅是近年来风靡全国各地的美食，火锅蘸料是火锅的灵魂搭配，它可与肉类、豆制品、蔬菜等搭配，缓解火锅带来的辛辣感、刺激感[1]。火锅蘸料产品的品质和风味将直接影响消费者对火锅食用兴趣[2]。火锅蘸料的原料种类复杂，原料微生物是影响食品生产的基础，未杀灭的微生物会在食品中继续繁殖导致食品腐败，在生产过程中若出现灭菌不彻底，易出现食品安全问题。国内外对于火锅类产品的研究主要集中在对火锅底料生产工艺优化、新品的开发等方面[3-7]，对于火锅蘸料原料微生物方向的相关研究还比较少[8]。

高通量测序技术（High-throughput sequencing）是一种高效便捷检测样品DNA分子的方法，它代替传统繁琐的检测步骤[9]，在检测样品时具有需求量少、检测速度快、结果准确率高等优点[10]，但其无法对产品中的微生物是否还存活进行判断。高通量测序可针对不同食物中的复杂微生物进行准确识别，被广泛应用于多种食品中，如豆豉[11]、泡菜[12]、酸菜[13]、发酵香肠[14]、腐乳[15]等。近年来利用该项技术对微生物分子生态学进行研究成为首选的方法[16]。试验采用高通量测序技术，探究蘸料原料的微生物菌群组成，了解原料中的优势菌种，从而为提高生产过程中的安全性和稳定性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

（A）蘸料半成品、（B）花生酱（花生仁经烘烤研磨后制得）、（C）韭菜花（韭菜花经腌制后获得）、（D）香辛料（桂皮、姜粉、茴香等）、（E）大豆粉（黄豆经烘烤后研磨制得），均由内蒙古呼和浩特市草原红太阳食品股份有限公司提供。

Q10212 Qubit3.0 DNA检测试剂盒（美国Life Technologies公司）；M5635-02 E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit（美国OMEGA公司）；P111-03 2×Taq Master Mix（中国Vazyme公司）；EC401-03 MagicPure Size Selection DNA Beads（中国TransGen Biotech公司）。

1.2 仪器与设备

Pico-21台式离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；GL-88B漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；DYY-6C电泳仪电源（北京市六一仪器厂）；DYCZ-21电泳槽（北京市六一仪器厂）；凝胶成像系统（美国UVP）EC3 310；T100TM Thermal Cyeler PCR仪（美国BIO-RAD公司）；Research plus 0.5～10 μL移液器（中国Eppendorf公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

称取200 mg原料样品，分别将5种原料加入已灭菌的离心管中，向离心管中加入1 mL 70%乙醇溶液，充分振荡使样品混合均匀，在10 000 r/min转速、室温下离心3 min，将上层液体弃置。向离心管中加入1倍的磷酸盐缓冲液，充分振荡使样品混合均匀，在10 000 r/min转速、室温下离心3 min，将上清液弃置。将离心管倒置于滤纸上方，保持1 min，直至离心管内没有液体流出。将样品管在50 ℃烘箱静置10 min，使离心管内残留的乙醇溶液完全挥发。

1.3.2 DNA提取

将蘸料半成品（A）、花生酱（B）、韭菜酱（C）、香辛料（D）、大豆粉（E）编号的火锅蘸料原料样品分别搅拌均匀，参照OMEGA试剂盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的试剂盒使用说明书，结合SDS裂解液冻融法对5种原料进行DNA提取，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，条带清晰即可进行后续操作。

1.3.3 PCR扩增及测序

利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，明确PCR反应需加入的DNA量。PCR所用的引物已经融合Miseq测序平台的V3-V4通用引物[17]：341F引物，CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物，GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GACTACHVGGGTATCTAATCC，进行扩增。DNA模板10 μL，高保真PCR试剂15 μL，前后F/R引物各1 μL（10 μmol/L），H2O 30 μL。将配制好的PCR体系进行第1轮PCR扩增，反应条件：预变性94 ℃保持3 min后分别进行变性、退火及延申操作，循环5次（变性温度94 ℃、时间30 s，退火温度45 ℃、设定时间20 s，延伸温度65 ℃、时间30 s）；进行变性、退火及延申操作，循环20次（变性温度94 ℃、时间20 s，退火温度55 ℃、时间20 s，延伸温度72 ℃、时间30 s）；延伸操作（温度72 ℃保持5 min）。

第2轮扩增，引入Illumina桥式PCR兼容引物，PCR 产物（第1轮）20 ng，高保真PCR试剂15 μL，前后F/R引物各1 μL（10 μmol/L），H2O 30 μL。将配制好的PCR体系进行PCR扩增，反应条件：预变性温度95 ℃、时间3 min，分别进行变性、退火、延伸操作，循环5次（变性温度94 ℃、时间20 s，退火温度55 ℃、时间20 s，延伸温度72 ℃、时间30 s），最终进行延伸操作（温度72 ℃、时间5 min），经过PCR扩增后，PCR产物进行琼脂糖电泳检测。使用Qubit 3.0检测试剂盒对回收的DNA精确定量，在Illlumina NovaSeq 6000 pair-end 2×150 bp平台进行双端测序。

1.4 数据处理

基于Illumina Miseq平台测序得到的样品文库，根据Barcode序列和PCR扩增引物序列区分各样本数据，对样本数据的质量进行质控过滤，得到各样本有效数据。将最终优化数据进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类分析，根据分析结果，采用Mothur 计算分析样品的Alpha多样性，分别绘制样品各分类学水平下的群落结构图、Heatmap热图、结合基于bary-curtis距离算法的PCA图，分析微生物结构组成差异。

2 结果与分析

2.1 火锅蘸料5种原料琼脂凝胶电泳鉴定

火锅蘸料5种原料PCR扩增产物琼脂凝胶电泳结果如图1所示。5个蘸料原料样本的PCR扩增产物条带在600 bp左右，与设计引物扩增长度接近，且其特异性和亮度均较好，可满足测序要求。

图1 细菌PCR扩增结果电泳图

2.2 火锅蘸料主要原料的测序结果质量分析

采用高通量测序获得火锅蘸料原料样品的原始序列数据后，得到5个样品细测的序列，共2 706 867条，其中样本细菌长度分布在425～446 bp，通过过滤筛除低质量序列，得到有效序列，共253 345条，长度分布在406～409 bp。数据经过预处理，最终得到的优质细菌序列分布统计见表1。

表1 细菌序列信息

2.3 蘸料中5种原料微生物多样性的分析

2.3.1 样品的OTU统计及分析

采用OUT统计工具，将几个样本的测序结果按照操作提示录入工具中，分别对测序结果筛选出来的细菌真菌有效序列进行聚类，结果如图2所示。样品细菌在OTU聚类后共得到1 732个OTUs，5个原料样品中有3个OTUs为原料共有，样品A特有OUT 151个，B特有OUT 105个，C特有31个，D特有442个，E特有16个，5个检测样本共有OUT 3个。

图2 样品OTU分布韦恩图

2.3.2α多样性分析

α多样性常用的度量标准包括Sobs指数、Chao指数、Shannon指数、ACE指数、Simpson指数和覆盖率。Sobs指数是指观测到的样本OTU数量，OTU数量可以代表样品物种的丰富度，每个OTU对应不同的微生物种[18]。Shannon指数和Simpson指数表示样品的多样性[19]，ACE指数和Chao指数表示物种的丰富度，通过检测和测序得到物种的覆盖率。Chao、ACE指数用于计算菌群丰度（community richness），二者指数越大，说明群落丰富度越高[20-21]。Shannon的值越大，说明检测样本的群落多样性越高，Simpson的指数值越大，则说明检测样本其群落多样性越低[22]。

如表2所示，样品D（香辛料）Shannon指数为3.87，明显较其他原料高，而样品B的Shannon指数较低，为2.00，且样品A的Shannon指数为2.12，样品E的Shannon指数为2.11，较相近并大于样品B的2.00，说明样品D中细菌群落的多样性较高、种类多，且样品D的ACE指数为388.29，Chao指数为2 124.40，也间接说明样品D香辛料中所含的物种丰富度较好，可能原因是原料自带的微生物较多，原料的生长环境也更适宜细菌生长繁殖，因此在生产中不但要加强原料的灭菌，还要着重把控好环境中的微生物。样品B的Simpson指数较高，Shannon指数较低，也说明该原料中细菌群落多样性较少，主要原因为原料较为单一。

表2 细菌α多样性指数

由图3的Rank abundance曲线可知，5个样品曲线跨度均较大，说明5种原料的微生物组成均较为丰富，均匀程度较高，其中大豆粉（E）的曲线水平跨度最低，曲线也较为平缓，说明微生物的丰富度较低，而样品香辛料（D）的水平跨度较大，曲线较为平缓，说明其原料中微生物的物种组成较为丰富，花生酱（B）的样品物种数量下滑曲线平滑，且曲跨度较小，说明较蘸料半成品（A）、韭菜花（C）、香辛料（D）、大豆粉（E）要好，也更加说明原料B（花生酱）的优势菌群占比较高，可能由于原料中的某一种或几种微生物所占比例较大，该原料的优势菌群占比较高，也间接说明该原料中的微生物多样性较低。

图3 高通量测序样本的Rank-abundance曲线

2.3.3 基于属水平的火锅蘸料原料菌群结构分析

在属分类水平上，5个火锅蘸料原料样本共检测到21个细菌属。从图4可以看出，假单胞菌属（Pseudomonas）和黄杆菌属（Xanthomonas）是5种原料中的绝对优势菌属，假单胞菌属（Pseudomonas）具有重要且多样的生态功能，更重要的是假单胞菌具有极强的环境适应性，分布十分广泛，其生长温度、pH适应范围较大[23]。Pseudomonas除D（香辛料）中占比在20%左右外，其余原料中均占到50%以上。原料D（香辛料）中的优势菌属为泛菌属（Pantoea），属于兼性厌氧菌，因此在进行生产过程中要着重注意该原料的灭菌时间及温度。

图4 细菌属水平的群落分类学组成和相对丰度分布

在属分类水平下，将火锅蘸料5种原料的细菌的群落组成按照最大相对丰度顺序排序，并绘制5种原料的物种丰度聚类热图，如图5所示。Heatmap图是以颜色梯度来表征二维矩阵或表格中的数据大小[24]，并呈现群落物种组成及物种的丰度信息，通过利用颜色的深浅变化方式反映所检测样本的细菌群落分布的丰度值[25]。从图5可以看出，韭菜花（C）和大豆粉（E）样品的细菌菌群丰度值较为接近，且相对丰度较小。而原料A（蘸料半成品）与原料B（花生酱）样品的相对丰度较大，主要是以假单胞菌属（Pseudomonas）、黄单胞菌属（Xanthomonas）为主，在火锅蘸料主要原料中原料D（香辛料）的细菌菌群丰度与其他原料的菌群丰度有较明显的差异，原料D（香辛料）主要是以泛菌属（Pantoea）和耶尔森菌属（Yersinia）等为主。通过Heatmap图分析表明，火锅蘸料5种原料样品中的细菌菌群丰度存在明显差异，说明不同原料在生产过程中所需的灭菌温度和时间需有针对性地把控，以保障产品生产安全。

图5 细菌属水平群落结构Heatmap图

2.3.4 主成分分析（principal component analysis，PCA）

X轴和Y轴表示2个选定的主成分轴，百分比表示主成分对样本组成差异的解释度值，通过主成分PCA分析，可以观察各样本间的离散和聚集情况[26]。图6中有5种形状方向各异的小图形，这些小图形分别表示火锅蘸料5种原料的样本来源，各点之间的距离大小，反映相应样本之间的菌群差异情况[27]。反之，若2个点之间的距离较为相近，则表明2个样本的物种组成越相似[28]。

图6 细菌群落结构的PCA分析

基于属水平条件对火锅蘸料的5种原料进行主成分（PCA）分析，分析结果如图6所示。PCA1的贡献率为89%，PCA2的贡献率为9%。在PCA分析结果中，样本B和样品A之间距离较小，表明这2种原料的原始菌落组成差异较小，而原料D样品距其他样品的距离较远，说明该原料样本的菌落组成与其他4种原料差异较大，分析原因可能是原料D为农业原料组成，生长环境较复杂，菌属涵盖范围较大。从整体看，5种原料微生物差异较大。根据图6可知，B、A样品菌群结构相近，与C、E原料样品的差异较小，与D原料的差异较大。这与属水平群落结构Heatmap图结果相同。

3 讨论与结论

采用高通量测序法对红太阳火锅蘸料5种主要原料的微生物群落结构进行检测，结合α多样性分析和Heatmap图表明，5种原料的菌群组成非常复杂，种类多，数量大，范围广。食品腐败的主要原因是产品中残留的微生物的代谢活动引起的食品酸败变质，利用高通量基因测序技术对火锅蘸料中5种主要原料微生物的多样性和丰度进行鉴定，分析可能影响火锅蘸料品质的菌株，为火锅蘸料生产过程的把控提供理论支持，为火锅蘸料的安全生产提供科学依据。在火锅蘸料的5种原料中假单胞菌属（Pseudomonas）都是优势菌种，而假单胞菌属（Pseudomonas）是一种腐败微生物，其含量超标在食用时会对人体健康造成一定影响。

通过高通量基因测序在蘸料原料中发现大量假单胞菌属（Pseudomonas），且有报道证明人体在食用含有假单胞菌属（Pseudomonas）食物会导致腹泻的发生[29-31]，而一些原料中自带的微生物为不可控因素，无法在入场时保障菌落总数＜10 CFU，但在生产过程中此类微生物均可通过高压灭菌处理杀灭。通过高通量测序技术对火锅蘸料的微生物进行鉴定，了解火锅蘸料5种主要原料的微生物菌群结构组成多样性，可在其他种类蘸料生产中参考此原料的主要优势菌种，根据这些微生物的生存特性对其进行控制，并杀灭有害菌群，保障食品生产的安全性。