芹菜素对高糖环境下人红细胞氧化损伤的保护作用

李怡斯，陈丽诗，黄熙照，张珊珊，宋丰林

广东药科大学食品科学学院（中山 528458）

芹菜素（apigenin，APG）是一种广泛存在于多种水果、蔬菜及茶叶中的天然黄酮类化合物。研究证明芹菜素具有抗炎、抗氧化、抑制血栓形成、抗肿瘤等作用[1]。在糖尿病大鼠模型中，芹菜素能通过抑制二肽基肽酶4（DPP-4）的活性，减轻胰岛细胞氧化应激、保护胰岛β细胞线粒体膜免受损伤等作用机制，降低糖尿病大鼠血糖水平[2-4]。

糖尿病是一种以血糖水平异常增高为主要特征的代谢性疾病，长期持续高血糖是糖尿病患者慢性血管并发症的主要原因[5]，并且会导致心脏、眼睛、肾脏和神经等器官的病变[6]。长期血糖升高对红细胞和血管内皮细胞，还有毛细血管壁造成损伤，导致红细胞膜的硬度增强，不利于红细胞的生理功能的发挥，尤其在微循环方面。红细胞过多聚集导致全血黏度升高，使得血管微循环发生障碍，这是诱发糖尿病血管并发症的主要原因。若长期糖耐量减低和控制血糖不当也会导致微血管并发症的发生[7]。

糖尿病会导致红细胞的血红蛋白和膜蛋白上出现不正常的糖化作用。高血糖扰乱了细胞的抗氧化防御体系，主要通过葡萄糖氧化、蛋白质的非酶糖基化及糖化蛋白质的氧化降解产生自由基的途径。组织中糖基化终产物（advanced glycation end-products，AGEs）的产生和积累与糖尿病及其并发症有关，AGEs与受体的结合导致细胞信号的改变和自由基的进一步产生，改变蛋白质和细胞的功能；血红蛋白对葡萄糖损伤尤其敏感，并且会导致血红素的完全破坏，高血糖导致的应激可以产生活性氧族（reactive oxygen species，ROS），进而改变血红蛋白的结构和功能[8]。

糖尿病治疗的目标是通过控制高血糖和代谢紊乱以消除糖尿病症状和防止出现并发症[9]，因此，临床治疗主要以药物控制血糖为主，以此来完成对患者血糖的有效控制，改善血糖指标，降低并发症发生率，取得良好的血糖控制效果[6]。试验通过在体外建立红细胞高糖损伤模型，以芹菜素作为干预物进行研究，通过红细胞溶血率、糖化血红蛋白（Glycated hemoglobin，GHb）、丙二醛含量（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等相关指标的测定来研究芹菜素对红细胞高糖损伤的保护作用，并探讨芹菜素可能的作用机制，为芹菜素用于防治2型糖尿病相关并发症提供研究基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

芹菜素标准品（CAS No.520-36-5，纯度≥98%，中国阿拉丁公司）；糖化血红蛋白（A056-1-1）、MDA测定试剂盒（A003-2）、GSH测定盒（A006-2-1）、CAT测定试剂盒（A007-1-1）、SOD测定试剂盒（均购自南京建成生物工程研究所）；0.01 mol/L PBS缓冲液（南京建成生物工程研究所）；CM-H2DCFDA ROS荧光探针（美国英杰生命技术有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 红细胞悬液制备与干预

红细胞悬液的制备：采集健康志愿者外周血，置于枸缘酸钠抗凝管中，以28 ℃，3 000 r/min离心10min，去除血浆和中间白细胞层。用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤红细胞3次，用PBS配成体积分数1%，4%和40%的红细胞悬液。

红细胞悬液分为对照组、高糖损伤模型组（模型组）、芹菜素不同剂量组（终浓度20，40和80 μmol/L），具体为：对照组，6 mmol/L葡萄糖干预；高糖损伤模型组，50 mmol/L葡萄糖干预；低剂量芹菜素干预组，50 mmol/L葡萄糖+20 μmol/L芹菜素；中剂量芹菜素干预组，50 mmol/L葡萄糖+40 μmol/L芹菜素；高剂量芹菜素干预组：50 mmol/L葡萄糖+80 μmol/L芹菜素。芹菜素干预组的红细胞悬液中分别加入不同剂量的芹菜素，使红细胞与干预物充分混匀后于37 ℃孵育30 min。除对照组外，其他各组红细胞中加入50 mmol/L葡萄糖，于37 ℃ 继续孵育24 h。

1.2.2 红细胞溶血率的测定

红细胞受到氧化损伤会导致其结构不完整，细胞膜破裂，引发溶血反应，胞内血红蛋白流出，致使培养的细胞悬液上清液呈现淡红色或红色。干预完成后的红细胞悬液用PBS按照1∶4（V/V）进行稀释，以3 000 r/min离心5 min，取200 μL上层清液测定其在540 nm波长下吸光度A。同时用预冷双蒸水处理红细胞培养液并置于冰上反应5 min，作为100%溶血对照，测定全溶血对照红细胞的吸光度A0，按式（1）计算各个试验组的红细胞溶血率。

式中：A为添加不同浓度芹菜素的样品测得的吸光度；A0为全溶血测得的吸光度。

1.2.3 糖化血红蛋白（Glycated hemoglobin，GHb）的测定

GHb含量可以反映机体的血糖情况，在试验研究中可以反映红细胞的损伤程度。试验将各试验组的红细胞悬液上清与沉淀混匀，用双蒸水按照1∶4（V/V）进行混合制备溶血液，置于冰上5min使红细胞完全破裂。根据试剂盒提供试验方法对GHb进行测定。

1.2.4 MDA、GSH和ROS含量的测定

取干预后的40%红细胞悬液，与预冷的双蒸水按1∶4（V/V）混匀后，冰浴5 min使红细胞充分溶血。按照MDA和GSH检测试剂盒说明书进行测定。另取1%红细胞悬液孵育完成后，加入终浓度10 μmol/L的ROS荧光探针CM-H2DCFDA，充分混匀后于37 ℃避光孵育30 min，以PBS洗涤3次，充分洗去未进入细胞的荧光探针，洗涤后的红细胞用PBS重悬，于流式细胞仪中测定红细胞ROS水平。

1.2.5 红细胞抗氧化酶活性的测定

40%红细胞溶液按照1.2方法进行处理，孵育完成后加入预冷的双蒸水使红细胞完全裂解，按照试剂盒说明进行红细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性的检测。

1.3 数据处理

数据采用SPSS 23.0统计学软件进行统计学分析，所有数据均表示为均数±标准差，单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），组间比较采用LSD-t检验进行分析，P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 芹菜素降低红细胞溶血率

红细胞孵育完成后，检测得到对照组红细胞溶血率为8.91%±1.81%，模型组红细胞溶血率较对照组明显升高，达16.78%±1.90%，且差异具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，芹菜素干预组红细胞的溶血率均有降低，20，40和80 μmol/L组溶血率分别为15.45%±1.63%，13.63%±1.73%和12.41%±1.67%，其中40和80 μmol/L组与模型组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 芹菜素对红细胞溶血率的影响

2.2 芹菜素降低红细胞GHb

如图2所示，50 mmol/L葡萄糖孵育后，红细胞GHb含量为7.53%±0.45%，与对照组（3.58%±0.41%）相比显著升高（P＜0.05）。20，40和80 μmol/L芹菜素干预后，红细胞GHb含量分别为6.89%±0.60%，6.30%±0.61%和5.18%±0.85%，与模型组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

图2 芹菜素对红细胞GHb的影响

2.3 芹菜素降低红细胞MDA、ROS生成并提高GSH含量

如图3（A）所示，与对照组相比，50 mmol/L葡萄糖孵育后红细胞中的MDA含量显著升高（P＜0.01），红细胞中ROS平均荧光强度也较对照组明显升高（图3 C），且差异具有统计学意义（P＜0.05）。与葡萄糖损伤组相比，中、高剂量芹菜素干预均能有效降低高糖环境下红细胞MDA和ROS的生成（P＜0.01）。

图3 芹菜素对红细胞MDA、ROS、GSH含量的影响

GSH在保护红细胞免受氧化损伤方面起着非常重要的作用。由图3（B）可知，高糖孵育使红细胞中GSH含量降低至0.79±0.30 nmol/mg Hb，与对照组（4.58±1.09 nmol/mg Hb）相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。20，40和80 μmol/L芹菜素干预后，红细胞GSH含量分别为0.98±0.44，1.59±0.43和2.16±0.43 nmol/mg Hb，其中40和80 μmol/L芹菜素干预组与模型组相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 芹菜素提高红细胞抗氧化酶活性

红细胞中SOD、CAT、GSH-Px在细胞抗氧化中发挥重要作用。由图4可知，与正常组相比，高糖损伤组红细胞内SOD、CAT、GSH-Px酶活性均受到明显抑制（P＜0.05）。与葡萄糖损伤组相比，芹菜素干预后红细胞中SOD的活性均显著提高（P＜0.05）。40和80 μmol/L芹菜素干预后，红细胞CAT活性分别升高至190.80±36.02和219.60±29.45 U/g Hb，与高糖损伤组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。对照组红细胞GSH-Px活性为81.90±5.37 U/g Hb，在高糖损伤组红细胞中其活性降低至63.81±6.74 U/g Hb，芹菜素可提高GSH-Px活性，其中80 μmol/L芹菜素干预组红细胞GSH-Px活性为74.00±5.57 U/g Hb，与高糖损伤组相比差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

图4 芹菜素对红细胞SOD、CAT、GSH-Px活性的影响

3 讨论

红细胞（red blood cells，RBCs）形如双凹圆盘，循环于全身组织器官并发挥气体交换的重要生理功能。在这一过程中，RBCs不断遭到ROS攻击，导致其渐进损伤和最终衰老，主要原因是RBCs的特殊结构。红细胞膜脂质富含不饱和脂肪酸，而多不饱和脂肪酸含有双键，持续暴露于高氧水平极易被过氧化。红细胞总蛋白的95%为富含自由基反应的催化剂Fe2+的血红蛋白（hemoglobin，Hb）。成熟红细胞无线粒体等细胞器，无法通过线粒体来消除ROS，所以损伤后很难自我修复[10]。红细胞的重要生理作用和特殊结构，使其更易受氧化应激损伤，因此其通常用作氧化应激研究的理想细胞模型。如果血液中血糖过高，便会结合蛋白质包裹住红细胞，使红细胞粘结在一起，增高血液的黏稠度，进而使血液循环减慢[7]。红细胞损伤是糖尿病并发症中的较为严重的一类，因此，利用红细胞进行抗氧化研究具有关键作用。

有研究结果指出，氧化应激是引发2型糖尿病和加重病情的重要因素[11]。机体内存在固有的清除和抑制自由基反应的体系，正常情况下保持氧化还原内稳态，机体产生ROS和抗氧化能力存在内稳态平衡。氧化应激是指ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）在机体内堆积过多，与抗氧化防御系统的清除之间失衡导致ROS和RNS过量产生，造成机体核酸和组织细胞及蛋白等大分子物质的损伤[12]。长期高血糖可通过线粒体电子传递链[13]、葡萄糖多元醇通路[14]和自氧化等途径增加机体内的ROS与RNS含量，从而导致氧化应激。机体抗氧化的初级防御系统是由酶类和非酶类抗氧化系统发挥清除和抑制自由基作用所构成。酶类抗氧化系统是体内的第一道抗氧化防线。线粒体电子传递链主要涉及酶复合物Ⅰ～Ⅳ、细胞色素c和辅酶Q，在酶复合物Ⅰ和Ⅲ中会持续产生少量的超氧产物，包括超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基，而SOD、CAT和GPx会对超氧产物进行催化将其转化成水和氧气。但如果在高血糖或者肥胖的情况下，超氧产物就会出现大幅增加的现象，当其清除速率不及产生速率时便会引发氧化应激[15]。体内第二道防线是非酶类抗氧化系统，它由小分子抗氧化物质组成，包括水溶性抗氧化剂GSH、蛋白抗氧化剂胆红素、脂溶性抗氧化剂维生素E、低分子化合物尿酸盐、植物化学物质、内源性褪黑素等。SOD、CAT和GSH等可将机体内多余的自由基清除，从而维持机体的氧化还原平衡[15-16]。因此，试验测定SOD、CAT、GSH-Px的活性和GSH含量，结果表明红细胞经高浓度芹菜素（80 μmol/L）干预后，红细胞中SOD、GSH-Px、GSH活性或含量均显著提高，但是CAT和GSH-Px活性不能恢复到对照组的正常水平，提示芹菜素可能通过提高红细胞内抗氧化酶活性发挥抗氧化作用。

红细胞膜脂质中不饱和高级脂肪酸被氧化，产生脂质过氧化物MDA，MDA是具有很强生物毒性的羰基化合物，极易与细胞膜磷脂、蛋白质等发生羰——氨交联反应，造成细胞膜结构的破坏和生理功能的丧失，最终导致细胞凋亡。MDA作为细胞膜脂质过氧化产物，是自由基致细胞损伤的标记物之一，能直接地反映体内自由基水平及脂质过氧化程度[17-18]。有研究表明，氧化应激条件下，红细胞中MDA的含量明显增加[19-20]，这与试验结果相吻合。芹菜素能在一定程度上显著降低MDA的含量，提示芹菜素可能抑制血红蛋白的氧化和不饱和高级脂肪酸的氧化，发挥对红细胞的保护作用，且能够保护红细胞免受自由基的损伤。

糖尿病患者的抗氧化能力降低，且其体内血浆和红细胞中过氧化产物的水平较正常人高。ROS是生物有氧代谢过程中的一种中间产物，对脂质、蛋白质和核酸具有潜在的氧化损伤能力[21-22]，当体内的抗氧化酶系（SOD、CAT和GSH-Px等）无法将其及时清除时，ROS便会因累积过多而对细胞和组织造成破坏，加重细胞损伤[19,23-25]。ROS可引起膜脂质过氧化使细胞膜通透性提高和功能的缺陷，诱发DNA损伤导致突变和死亡，富含巯基的蛋白质交联和硫化，致使非弹性老化蛋白的产生，特别是存在于细胞外基质的胶原。试验表明，芹菜素能有效降低ROS的产生，从而减轻自由基和活性氧对红细胞的破坏，起到抗氧化作用。

4 结论

结果显示：芹菜素能够抑制高浓度葡萄糖氧化损伤引起的红细胞溶血，降低红细胞中GHb、MDA和ROS的含量，提高红细胞中GSH-Px、SOD、CAT活性和GSH含量，提示芹菜素可能通过提高红细胞内抗氧防御化能力对高浓度葡萄糖导致的红细胞氧化损伤发挥保护作用。综上，芹菜素可能对糖尿病相关并发症的发生具有一定预防保护作用，表明其作为食品功能性成分，在膳食预防和缓解糖尿病并发症方面有广阔的应用远景，可对膳食防治糖尿病提供理论与方法指导。