中药栀子治疗IgA 肾病的网络药理学研究∗

庞欣欣，王学艺，朱 清，商海涛，彭紫凝，韩佳瑞△

1 河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450002；2 河南中医药大学第二临床医学院，河南 郑州 450046

IgA 肾病（immunoglobulin A nephropathy，IgAN）是最常见的原发性肾小球肾炎，也是慢性肾脏病和终末期肾脏病的主要病因［1］。IgAN的病理特征是在肾小球系膜区以IgA 沉积为主，临床表现为血尿，可伴有蛋白尿、高血压和肾功能受损等表现［2-3］。IgAN 的发病机制尚不清楚，有关IgAN的多种假说尚不能解释IgA 沉积相关的肾损害，目前的治疗方法尚不能阻断IgAN 的进展［4-5］，约15%～40%的患者在确诊十年内发展成终末期肾病［6］。

中医药对IgAN 的治疗有独特的优势。IgAN中医辨证大多为本虚标实、虚实夹杂。湿热证是IgAN的重要证型［7-8］。栀子味苦性寒，入心、肺、三焦经，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒的功效，主治热病心烦、黄疸尿赤、血淋涩痛、热毒疮疡等。药理研究表明，栀子有抗炎、抑制氧化应激、降低胆固醇和低密度脂蛋白、改善血管内皮功能紊乱等作用［9］。国医大师张琪教授在辨治IgAN 尿血时，对辨证属瘀热互结或肾阴亏虚者，在经验方中均用栀子清热解毒［10］。本研究通过网络药理学的方法挖掘栀子治疗IgAN 的有效成分及作用靶点，同时构建栀子有效作用靶点与IgAN 疾病靶点的蛋白互作网络，预测栀子治疗IgAN 的相关靶点。进一步对这些靶点进行疾病-药物-分子-靶点互相作用的可视化分析、基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，为栀子治疗IgAN 的作用靶点和机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 对栀子有效成分的筛选通过检索中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）挖掘栀子的所有化学成分，根据各个成分的吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）及排泄（excretion），即ADME（absorption、distribution、metabolism、excretion）参数筛选有效成分，其中筛选条件为药物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，药物相似性（drug like，DL）＞0.18［11］。

1.2 栀子的作用靶点和lgAN的相关靶点检索采用TCMSP 数据库，以“Gardeniae Fructus”为关键词预测筛选栀子有效成分作用靶点。GeneCards是公共集成数据库，提供了来自约150个网络来源的以人类基因为中心的全面基因注释和预测信息，包括基因组学、转录组学、遗传信息学、临床基因信息等［12］。以“IgA nephropathy”为关键词在Gene Cards 里筛选与IgAN有关的所有靶点，并在TTD、DrugBank、DisGeNET、GAD 等数据库中筛选补充［13］。

1.3 蛋白互作网络构建和关键靶点筛选蛋白质-蛋白质相互作用关系（protein-protein interaction，PPI）是数据挖掘的重要途径。应用STRING 数据库预测蛋白质之间的相互关系并构建PPI 网络，利用该数据库构建栀子作用靶点与IgAN靶点的交集PPI网络并筛选核心靶点［14］。筛选参数设置主要有：生物机体选择为人类，最低要求交互分数设置最高置信度0.4。

1.4 栀子治疗lgAN 网络调控的可视化基于栀子和IgAN 的蛋白互作靶点数据，引入栀子可作用于IgAN 的有效成分，提取两者交集，采用Cytoscape 3.7.2 软件把这些数据制作成可视化网络图，其中“圆形”代表靶蛋白，“三角形”代表分子，以“边”表示不同成分与靶点之间的关系，挖掘其相互之间的作用关系。即得到栀子治疗IgAN 的疾病-药物-分子-靶点调控网络图。

1.5 GO 和KEGG 富集分析DAVID 数据库广泛应用于基因注释，可通过该数据库挖掘基因与疾病的相关性。GO 分析是生物学领域中用于基因产物细胞功能、分子功能和生物功能的分类的系统，可以通过DAVID 工具进行GO 富集分析。同时，应用DAVID工具对栀子和IgAN交集蛋白靶标基因进行KEGG通路富集分析，得到栀子治疗IgAN的主要作用通路。GO和KEGG富集分析，考察栀子的潜在靶标可能具有的生物学功能，参与的生物学通路［15］。校正统计学超几何分布定量（P.adjust值）来评估存在于各GO和KEGG注释中的蛋白生物学功能和通路富集情况的显著性，P.adjust 值在图中颜色越红，则显著性越强。

2 结果

2.1 栀子有效成分的ADME分析检索TCMSP数据库中栀子的所有成分，按照OB＞30%和DL＞0.18进一步筛选出栀子有效成分15个。见表1。

2.2 栀子的作用靶点和lgAN 的相关靶点检索结果通过TCMSP 数据库查找到15 个有效成分，其中，只有12 个有效成分具有相对应的靶点，对这12 个有效成分进行靶点基因注释，删去重复靶点，得到95个有效预测药物靶点。在GeneCards、TTD、DrugBank 等数据库中筛选IgAN 相关靶点，删除重复数据，共得到1346 个与疾病相关的靶点。取栀子和IgAN的有效靶点交集，得到41个共同靶基因。见图1。

图1 栀子活性成分有效靶基因与IgAN相关靶基因

2.3 栀子-lgAN作用靶点蛋白互作关系分析取栀子和IgAN的有效靶点交集，得到41个栀子-IgAN相互作用靶点。采用STRING 数据库进行PPI 分析，得到352条PPI关系。取其中富集节点数目最多的前30 个靶点，做出柱状图，得到前30 个栀子-IgAN 核心靶点。其中横轴为富集节点数目，纵轴为靶点基因名称。核心靶点主要有炎症因子、血管内皮生长因子、蛋白激酶、细胞凋亡相关因子等。见图2—3。

图2 栀子与IgAN的PPI关系图

图3 栀子治疗IgAN的核心作用靶点

2.4 栀子治疗lgAN网络可视化分析通过Cytoscape 软件进行栀子治疗IgAN 的网络的疾病-药物-分子-靶点互相作用的可视化分析。纳入上述PPI 网络筛选的41 个基因和分析筛选，得到9 个栀子可用有效成分，同时在网络中加入疾病和药物使网络图更加直观。网络可视化图，见图4。

图4 栀子-IgAN-有效成分-靶点网络关系图

2.5 栀子治疗lgAN 的机制分析对栀子和IgAN交集蛋白靶标基因采用DAVID 工具进行GO 分析，得到栀子可治疗IgAN 的作用靶点的生物学功能77 种，综合分析后取前10 种功能特性，得到栀子有效成分靶点主要通过这些生物学功能特性治疗IgAN，如DNA 结合转录因子结合性、泛素连接酶结合性、泛素样蛋白连接酶结合性、抑制转录因子结合性、激活转录因子结合性等。再采用DAVID 工具进行KEGG信号通路分析，发现栀子治疗IgAN信号通路有120条，综合分析后取前20条信号通路。KEGG分析显示，栀子治疗IgAN的有效靶点主要在晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end products，AGEs）-受体（receptor of AGEs，RAGE）信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、前列腺癌、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路等。其中气泡或柱形图颜色越红，则校正P值越高，显著性越强，气泡大小越大或柱形越长，则该生物学功能或该通路富集的靶点越多。根据排名，找到这些靶点最关键的AGEs-RAGE 信号通路图，同时用红色表示栀子靶点在该信号通路上具体作用点，见图5—7（所有结果均符合P.adjust＜0.05）。

图5 栀子治疗IgAN的相关生物学功能

图6 栀子治疗IgAN关键信号通路

图7 AGEs-RAGE信号通路图

3 讨论

含有IgA1 的免疫复合物在系膜区沉积是IgAN 的特征性病理表现［16-17］。30%～40%的IgAN患者发展为进行性肾功能下降，需要在诊断后二十年内进行肾脏替代治疗。IgAN 发病机制复杂，目前尚无有效治疗药物来阻断病情的进展［18］，因此，探索中医药治疗IgAN的手段至关重要。

中医中并无IgAN 的病名记载，根据临床表现，可归于“尿血”“水肿”“腰痛”“虚劳”“肾风”等疾病范畴［19］。罗登贵等［8］运用数据挖掘技术整理了八十余位中医名家治疗IgAN 的经验文献，发现风热、湿热、气虚、阴虚是本病的关键病机，凉血止血、活血化瘀、益气滋阴、清热利湿、清热解毒、补益脾肾为主要治法。刘童童等［20］分析了469 例IgAN 患者湿热证与临床病理的相关性，发现湿热证的程度与IgAN 患者临床病理的严重程度呈正相关。因此，湿热证是IgAN 重要的中医病机。湿性趋下，易侵袭下焦，阻滞气机运行，影响脏腑气化，湿性黏滞，易造成IgAN 的缠绵难愈，湿与热合，如油入面，难解难分，湿欲下行而热留之，热欲上行而湿阻之，使疾病更加迁延难愈［21］。“治湿热之法，以清热利小便为最好”，栀子清热利湿，泻火解毒，切中IgAN病机。

栀子对IgAN 治疗作用所涉及的靶点和机制目前尚不完全清楚。庞欣等［22］发现，栀子苷通过调节NLRP3来减轻IgAN模型小鼠炎症反应和氧化应激。本研究应用网络药理学方法系统地预测了栀子作为IgAN 的潜在分子机制。研究发现，栀子作用机制涉及多通路、多靶点。本研究筛选栀子入血的活性成分15个，模拟预测95个有效作用的靶点和352 个相互作用关系，“活性成分-靶点”网络分析结果显示，包括栀子对藏红花酸、槲皮素、山奈酚、豆甾醇等有效成分能作用于网络中的多个靶点，比如白细胞介素6、血管内皮生长因子、细胞凋亡相关因子、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、有丝分裂原活化蛋白激酶、表皮生长因子受体等靶点。而通过针对栀子治疗IgAN 的有效成分靶点进行功能富集分析，发现栀子主要通过以下这些生物学功能特性治疗IgAN，如DNA结合转录因子结合性、泛素连接酶结合性、泛素样蛋白连接酶结合性、抑制转录因子结合性、激活转录因子结合性等。

本研究进一步针对关键靶点进行通路富集分析，结果显示，栀子治疗IgAN 最关键的通路为AGEs-RAGE信号通路。AGEs-RAGE信号通路作用广泛，可激活下游核转录因子κB，核转录因子NF-κB异常高表达并进入细胞核，与多种基因启动子特异性序列结合，引起大量黏附分子、生长因子、促炎细胞因子等的表达和释放，引起组织细胞的结构损伤和功能障碍［23-24］。AGEs-RAGE 促进转化生长因子1 的产生，增强单核细胞趋化蛋白1 的表达，最终造成肾脏组织纤维化［23］。因此，栀子可作用于AGEs-RAGE 下游相关通路中的多个靶点从而发挥治疗作用，但目前尚无AGEs-RAGE在IgAN治疗中的相关研究，可作为未来研究的方向进一步研究。

综上所述，栀子治疗IgAN 主要涉及DNA 结合转录因子结合性、泛素连接酶结合性、泛素样蛋白连接酶结合性、抑制转录因子结合性、激活转录因子结合性等生物学特性，并涉及AGEs-RAGE 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、前列腺癌、肿瘤坏死因子信号通路。基于网络药理学和生物信息学分析能有效地揭示栀子治疗IgAN 可能的作用机制，为后续进一步临床和实验研究设计等提供重要的理论依据，也为IgAN 的治疗指明了新的方向。