不同基原吴茱萸药材中质量标志物预测分析:基于网络药理学和指纹图谱

邢菊玲,罗宇琴,吴文平,杨晓东,刘晓琳,李国卫,邓成程,罗文汇1,*

(1.广东一方制药有限公司,广东 佛山 528244;2.广东省中药配方颗粒企业重点实验室,广东 佛山 528244;3.湖南一方天江药业有限公司,湖南 常德 415000)

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang 或疏毛吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实,又名食茱萸、吴萸、茶辣、漆辣子等,始载于《神农本草经》,列为中品,其味辛、苦,热,有小毒,归肝、脾、胃、肾经,具有温脾止泻、散寒止痛、降逆止呕等功效,常用于厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹胀痛、呕吐吞酸、五更泄泻等[1]。原植物以栽培为主,全国各地都有大面积的栽种,主产于江西、广西、安徽、重庆等地区[2],但因各地采收季节差异、异地引种及基原多样等原因,导致各地吴茱萸药材的质量差异非常大[3],因此,建立一套完善的吴茱萸药材质量控制及评价体系,对于确保优质及稳定的药材资源十分重要。

2016年刘昌孝院士首次提出中药质量标志物(Quality markers,Q-Marker)概念,提出基于溯源与传递性、特有性、可测性、有效性以及处方配伍这5项核心原则,进行中药安全性及有效性的标示性物质的质量研究[4-5]。另外,网络药理学(Network pharmacology)作为新兴学科,是以系统生物学和药理学为理论基础,应用生物分子网络分析方法揭示了“药物-基因-靶点-疾病”之间复杂的网络关系[6]。目前,已广泛将其运用于单味中药及复方中药的研究[7-8]。本研究整合化学、数理统计及生物信息学等多种方法,进行吴茱萸网络药理学及指纹图谱的潜在Q-Marker预测,旨在建立吴茱萸药材的质量控制方法,为吴茱萸的质量控制及后续开发提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪(Waters H-Class,沃特世公司);YMC Triart C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.9μm);万分之一分析天平(ME204E,梅特勒-托利多公司);百万分之一分析天平(XP26,梅特勒-托利多公司);数控超声波清洗器(KQ500D,昆山市超声仪器有限公司);恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司,型号:HWS28型);超纯水系统(默克股份有限公司,Milli-Q Direct)。

1.2 试药

新绿原酸(批号:wkq18030107,含量98%,四川维克奇生物科技有限公司);绿原酸(批号:110753-202018,含量96.1%);金丝桃苷(批号:111521-201809,含量94.9%);橙皮苷(批号:110721-202019,含量95.3%);去氢吴茱萸碱(批号:112075-202101,含量99.6%)、吴茱萸碱(批号:110802-201710,含量99.6%)、吴茱萸次碱(批号:110801-201608,含量99.7%),均购自中国食品药品检定研究院;乙醇(天津市富宇精细化工有限公司,分析纯);甲醇(天津市富宇精细化工有限公司,分析纯);磷酸(天津市富宇精细化工有限公司,色谱纯);乙腈(默克股份有限公司,色谱纯);水为超纯水(实验室自制)。研究所用药材,经广东一方制药有限公司主任中药师魏梅进行鉴定。鉴定结果,见表1。

表1 吴茱萸药材来源

2 方法与结果

2.1 网络药理学对吴茱萸药材的Q-Marker预测分析

2.1.1 吴茱萸活性成分的筛选 通过中药系统药理学分析平台(TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和中医药整合药理学研究平台(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/),以“吴茱萸”为关键词进行检索,其中TCMSP数据库获得口服生物利用度(OB≥30%)及类药性(DL≥0.18)的化学成分共30个,相关靶点共201个;TCMIP数据库获得16个有效成分,相关靶点共133个;再通过靶点标准化数据库UniProt(https://www.uniprot.org/)上传上述得到药物成分靶点(target name),蛋白种属设置为“Homo sapiens(Human)”,删除重复靶点后共得到活性成分相关靶点,共209个。

2.1.2 蛋白质相互作用(PPI)的构建及其核心网络筛选 将上述靶点导入在线网站STRING 11.5(https://string-db.org),选用Multiple proteins 工具,种属设置为“Homo sapiens(Human)”,获取蛋白相互作用关系,根据最高级筛选条件“highest confidence(≥0.9)”,得到联系最紧密的PPI网络,并保存TSV格式文件。将文件中的node1,node2,combined score整理导入Cytoscape 3.6.1软件进行网络拓扑结构分析,得到蛋白质相互作用图(图1),该网络含有119节点和736条边,网络中靶点大小和颜色可反映节点degree值和节点之间的combined score,并应用插件Network Analyzer分析网络节点度Degree,其中,degree值排名前3的基因分别是ESR1(degree=23)、RELA(degree=22)、PIK3R1(degree=20)、RXRA(degree=20)。

图1 蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络

2.1.3 GO生物过程和KEGG通路富集分析 通过DAVID数据库,上传上述得到的209个靶蛋白基因并进行GO生物过程及KEGG信号通路的富集分析。以P<0.05为筛选条件,共得到了119个GO条目,主要涉及神经递质受体、类固醇激素受体、核受体活性及配体门控离子通道活性、门控氯离子通道活性等分子功能。另外,KEGG结果分析,共富集157条信号通路(P<0.05),主要涉及脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、钙信号通路、小细胞肺癌、甲状腺激素信号通路、血管内皮生长因子信号通路、AGE-RAGE信号通路和cAMP等信号通路,并根据P值从小到大排序,选择P值在Top20条的KEGG信号通路进行可视化处理。见图2。

图2 KEGG通路富集分析气泡图

2.1.4 “活性成分-靶点-通路网络”的构建 将上述Top20条的KEGG信号通路及对应靶点及成分导入软件Cytoscape 3.6.1得到吴茱萸活性成分-靶点-通路网络图(图3),该网络包含173个节点、609条边,其中紫色菱形代表活性成分(30)、黄色椭圆代表靶点(123)、红色六边形代表信号通路(20),可见一种活性成分对应多个靶点,一个靶点也对应多种成分、多条通路,从而更加直观地体现了中药多成分、多靶点、多通路的特点,其中,网络节点度Degree值较高的成分有槲皮素(degree=49)、Goshuyic Aci(degree=22)、异鼠李素(degree=12)、β-谷甾醇(degree=12)、花色苷(degree=10)、Synephrine(degree=8)、吴茱萸酰胺甲(degree=8)、吴茱萸碱(degree=6)、Rutalinidine(degree=5)、1-甲基-2-壬基-4-喹诺酮(degree=5)、小檗碱(degree=4)、吴茱萸次碱(degree=4)、1-甲基-2-十五烷基-4-喹诺酮(degree=4)、吴茱萸卡品碱(degree=4)、穆茱萸酰胺(degree=4),Degree值较高的靶点有AR(degree=19)、PIK3R1(degree=15)、PIK3CA(degree=15)、RELA(degree=14)、RAF1(degree=14)、CHRM1(degree=13)、CHRM3(degree=12)、CASP9(degree=12)、PRKCA(degree=12),表明吴茱萸能通过以上核心活性成分及核心靶点作用于AGE-RAGE信号通路、cAMP等信号通路来发挥作用。

图3 活性成分-靶点-通路网络

2.2 吴茱萸指纹图谱定性分析

2.2.1 色谱条件 色谱柱为YMC Triart C18(100mm×2.1mm,1.9μm);流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脱:0～9min,92% B;9～18min,92%～70% B;18～28min,70%～20% B;28～33min,20%～0% B;体积流量为0.3mL/min;柱温为30℃;进样量为1μL;检测波长为254nm,理论板数按吴茱萸碱峰计算应不低于5 000。

2.2.2 对照品溶液制备 取新绿原酸对照品、绿原酸对照品、金丝桃苷对照品、橙皮苷对照品、去氢吴茱萸碱对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品适量,精密称定,加70%甲醇溶液制成每1mL各含5μg的混合溶液,即得。

2.2.3 供试品溶液制备 取吴茱萸药材(过四号筛)约0.3g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇50mL,称定重量,超声处理(功率300W,频率40kHz)40min,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.4 方法学考察 (1)精密度考察:取同一供试品溶液,按照“2.3.1”项下色谱条件,重复进样6次,记录色谱图,以与吴茱萸碱参照物相应的峰为S峰,计算各特征峰与S峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示各特征峰的相对保留时间与相对峰面积RSD值<3%,表明仪器精密度良好。

(2)重复性考察:取同一批吴茱萸药材粉末(过四号筛)适量,共6份,按照“2.3.4”项下方法制备供试品溶液,按照“2.3.1”项下色谱条件,进样分析,记录色谱图,以吴茱萸碱峰为S峰,计算各特征峰与S峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值<3%,表明该方法的重复性良好。

(3)稳定性考察:取同一供试品溶液,按照“2.3.1”项下色谱条件,分别在0、2、4、6、8、12h进样分析,记录色谱图,以吴茱萸碱峰为S峰,计算各特征峰与S峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值<3%,表明供试溶液在12h内稳定性良好。

2.2.5 样品测定 取18批吴茱萸样品,按照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液,按照“2.3.1”项下色谱条件进样分析,得到18批吴茱萸UPLC指纹图谱。将所得数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012 年版),建立指纹图谱并生成指纹图谱共有模式(图4)。指纹图谱中共标定出18个共有峰,通过与对照品比对,分别指认出新绿原酸(峰4)、绿原酸(峰6)、金丝桃苷(峰9)、橙皮苷(峰11)、去氢吴茱萸碱(峰12)、吴茱萸碱(峰14)、吴茱萸次碱(峰15)等7个共有峰,其中,吴茱萸碱(峰14)出峰位置适宜,色谱峰较稳定、响应值高,故确定为参照峰S。

图4A 吴茱萸UPLC指纹图谱叠加

2.2.6 数据分析 (1)相似度分析:对18批样品的指纹图谱峰面积(表2),通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012B)软件进行匹配,以平均数法进行共有峰标识,分别得到不同来源样品相似度。计算结果,见表3。

表3 18批吴茱萸样品指纹图谱相似度分析结果

从上述相似度分析结果来看,结合基原差异,得到18批样品与对照模式相似度为:吴茱萸基原相似度为0.993～0.984、石虎基原相似度为0.531～0.816,从整体来看,以吴茱萸基原样品相似度较高。

(2)聚类分析:对18批吴茱萸药材指纹图谱峰面积进行分析,通过SPSS 20.0版软件进行系统聚类,采用组间连接法,选用平方欧氏距离为样品间距离计算方法,得到聚类分析结果,见图5。

从上图可知,可将吴茱萸药材分为2类,其中S1～S10为第一类,均为吴茱萸基原药材;S11～S18为第二类,均为石虎基原药材,说明不同基原吴茱萸药材差异显著,与相似度分析结果一致。

(3)主成分分析:应用SPSS 20.0软件对不同产地吴茱萸药材指纹图谱峰面积进行分析,进行标准化处理后进行主成分分析,得出相关矩阵的特征值及其方差,抽样适合性检验系数KMO值=0.624>0.6,巴特利特球形度P= 0.00<0.05,主成分分析结果见表4、图6。由表4可知,前2个成分的特征值>1,对总方差的累积贡献率达88.737%,故选择上述两个成分作为第1和第2主成分,且碎石图中前2个特征值的变化曲线陡峭,表明这2个主成分因子可作为吴茱萸药材整体质量评价指标。

图6 碎石图

表4 解释的总方差

成分矩阵见表5,由表5可知,峰主成分峰1～3、9、11、13～16、18在主成分1上载荷绝对值最大,峰12主成分3上的载荷量最大。说明包括峰14(吴茱萸碱)、峰15(吴茱萸次碱)等在内的生物碱类成分及其他有机酸类成分对吴茱萸药材整体质量影响较大。

表5 成分矩阵

应用主成分分析方法,根据因子得分系数矩阵及特征向量法,得出综合评价函数Y综合得分表达式为:Y=0.079 528×Y1+0.009 209×Y2,其中Y1、Y2为各批次样品与2个主成分得分。计算所得18批样品的主成分得分,见表6,从分析结果可知,相较于石虎,吴茱萸基原综合得分较高,药材质量总体上较好。

表6 样品得分

3 讨论

吴茱萸为临床常用中药,其原植物来源于芸香科吴茱萸属植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥未成熟果实。其植物形态特征较为相似,目前药用的吴茱萸主要以栽培为主,野生较少,从分布情况来看,吴茱萸主要分布于江西、贵州、重庆部分地区,石虎主要分布在江西、湖南等地,疏毛吴茱萸主要分布于贵州、浙江、陕西等省的部分地区[9]。熊红红[10]对吴茱萸商品药材流通情况进行了调查,发现吴茱萸主要商品药材以原植物来源的吴茱萸的各种栽培品种为主,以石虎来源为辅,疏毛吴茱萸在市场上所占比例很小,且疏毛吴茱萸产地较少,种植面积较小。因此,本研究结合吴茱萸资源分布情况及研究的代表性,综合收集了来自江西、广东等产地的多批吴茱萸、石虎样本,由相似度分析结果可知,吴茱萸基原相似度在0.993～0.984,石虎基原相似度在0.531～0.816,即吴茱萸基原样品相似度较高,且与石虎基原样品有显著区别;由聚类分析结果可知,18批次吴茱萸样品可分为2类,其中S1～S10吴茱萸基原药材归为第一类,S11～S18石虎基原药材归为第二类,结果同相似度分析。说明不同产地、不同生长环境对吴茱萸药材质量有一定的影响。

本研究通过网络药理学的方法进行吴茱萸药材Q-Marker的预测分析,共涉及有效成分30个、相关靶点209个,通过PPI网络筛选出ESR1、RELA、PIK3R1、RXRA等关键靶点;通过GO、KEGG通路富集分析筛选出癌症通路、AGE-RAGE信号通路和cAMP等关键通路;构建的“活性成分-靶点-通路网络”进一步表明,吴茱萸中槲皮素、异鼠李素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱等活性成分能通过激活AR、PIK3R1、PIK3CA等核心靶点作用于癌症通路、cAMP等信号通路,发挥关键性作用。现代研究表明,吴茱萸中的喹唑啉咔生物碱吴茱萸碱能在不影响线粒体功能的前提下激活293T细胞AMPK信号通路,从而发挥作用[11,12]。另外,阳霞[13]研究发现,吴茱萸碱还可作为Notch3表观遗传修饰剂,抑制Notch通路激活,有效阻滞细胞周期,抑制细胞增殖,具有预防肺癌发生及降低肿瘤恶性等作用。本研究结果与以上报道相符,反映了本研究数据的可靠性。在活性成分-靶点-通路网络中degree值排名靠前的核心成分有槲皮素、Goshuyic Acid、异鼠李素、β-谷甾醇、花色苷、Synephrine、吴茱萸果酰胺I、吴茱萸碱、Rutalinidine、1-甲基-2-壬基-4-喹诺酮、小檗碱、吴茱萸次碱、1-甲基-2十五烷基-4(1H)-喹诺酮、吴茱萸卡品碱、穆茱萸酰胺,其中槲皮素、异鼠李素、β-谷甾醇、花色苷以及小檗碱存在于多种中药材中,具有多种生物活性[14-16],因此不能作为辨别药材质量的标志性成分;其余的均为吴茱萸生物碱类化合物,根据其结构类型可分为三类、吲哚类生物碱(吴茱萸果酰胺甲、吴茱萸碱、吴茱萸次碱)、喹诺酮类生物碱(1-甲基-2-壬基-4-喹诺酮、1-甲基-2-十五烷基-4-喹诺酮、吴茱萸卡品碱)及其他类生物碱(辛弗林、Rutalinidine、穆茱萸酰胺),其中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量最高,为吴茱萸的主要活性成分,同时也是《中国药典》中吴茱萸的含量检测指标性成分,具有强心、调节心律、抗动脉粥样硬化、降血脂、降血糖、抗炎、抗肿瘤、抗多种癌症(肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌)等多重药理功效[17-27]。因此,基于化学成分的有效性,可将吴茱萸碱和吴茱萸次碱作为吴茱萸的Q-Marker。

本研究通过收集18批吴茱萸基源和石虎基原药材,通过UPLC法建立指纹图谱,共确立了18个共有峰,并指认了7个色谱峰(新绿原酸、绿原酸、金丝桃苷、橙皮苷、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱)。该方法具有良好的精密度、稳定性和重复性,能有效定性鉴别吴茱萸、石虎基原药材;同时,数理统计结果表明,吲哚类生物碱类成分吴茱萸碱、吴茱萸次碱类对吴茱萸药材整体质量影响较大,说明吴茱萸Q-Marker的选取符合化学特性。

由于中药化学成分复杂,具有多成分、多靶点、多通路的特点,建立质量标准并进行质量控制研究是保障临床疗效和促进中医药发展的关键性问题,本研究基于Q-Marker“五原则”,通过吴茱萸网络药理学、指纹图谱及数理统计等多种方法,从化学和生物信息学等角度预测吴茱萸药材潜在的Q-Marker,为后期吴茱萸质量评价标准的提升及作用机制的深入研究提供了参考依据。