碱提酸沉法提取补骨脂中补骨脂乙素的工艺研究

孙小龙,戴轶群,马 慧,俞俊霞,李红梅,朱美林,吴成柱

中药补骨脂为补骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果实,具有补肾壮阳、补脾健胃等功效[1-2]。现代研究[3-4]表明,补骨脂含有香豆素类、黄酮类、单萜类等多种成分,具有抗菌、抗肿瘤、治疗骨质疏松、雌激素样作用以及治疗白癜风等药理活性[5-7]。其中,补骨脂中的黄酮类化合物补骨脂乙素对肿瘤细胞具有较强的增殖抑制作用,已被逐渐开发和利用。补骨脂乙素具有抗炎[8]、抗菌[9]、抗肿瘤[10-11]等多种药理活性。但是,目前对于从补骨脂中提取补骨脂乙素的工艺研究较少,鲜有的几篇报道主要通过浸提法、超临界CO2萃取以及回流法[12],这些方法具有提取效率低、能耗大等缺点,不能用于补骨脂乙素的大批量生产。碱提酸沉法具有低能耗、低污染、毒性低、高效率的特点,可以用于中药成分的大量提取。本研究采用单因素试验以及正交试验,优化碱提酸沉法提取补骨脂乙素的提取工艺,建立了一种高效率、无污染、可行性高的提取方法,这为今后提取补骨脂乙素提供了一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 补骨脂(江苏南京上元堂大药房) ;补骨脂乙素标准品(宝鸡市辰光生物有限公司,纯度98.0%) ;碳酸钠(分析纯,上海展云化工有限公司);盐酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);甲醇、乙腈(色谱纯,美国天地有限公司);三氟乙酸(分析纯,美国天地有限公司)。

1.2 仪器 SOPTOP电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司),LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司),MixPlus旋涡混合仪(合肥艾本森科学仪器有限公司),L550离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),Milli-Q超纯水仪(美国Milipore公司),WK-1000A小型高速粉碎机(山东精诚医药装备制造有限公司) ,DHG-9123A烘箱(上海精宏科技有限公司)。

1.3 溶液配制

1.3.1 供试品溶液的制备 将补骨脂粉末加入碳酸钠水溶液中,超声后过滤,滤液用盐酸调pH后再过滤,将干燥后的滤渣用色谱甲醇溶解,用微孔滤膜过滤后备用。

1.3.2 对照品溶液的制备 称取1.60 mg补骨脂乙素标准品,用色谱甲醇配成5.12 mg/mL后依次稀释8倍,则对照品溶液浓度依次为640.00、320.00、160.00、80.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50 μg/mL。

1.3.3 色谱条件 液相色谱柱为Waters Sun FireTMC18(4.6 mm ×250 mm,5 μm),在进样量为20 μL、流速为1 mL/min、柱温为40 ℃、检测波长为254 nm的条件下进行检测,其中,流动相为0.05%的三氟乙酸水溶液(A)和乙腈(B)进行梯度洗脱(0～30 min,20% B～100% B;30～40 min,100% B;40～45 min,100% B～20% B;45～47 min,20% B) 。

1.4 方法学考察

1.4.1 专属性 按照“1.3.3”项下的色谱条件对对照品和供试品进行分析,记录色谱图。

1.4.2 标准曲线的制备 将配制好的补骨脂乙素对照品溶液按照“1.3.3”项下色谱条件进样分析,记录峰面积并绘制标准曲线,其中纵坐标表示峰面积,横坐标表示浓度。

1.4.3 加样回收率试验 按照“1.3.1”项下方法将称取的6份补骨脂乙素供试品制备为供试品溶液,按照“1.3.3”项下色谱条件测定6份溶液的峰面积;另取6份相同体积的供试品溶液,分别加入一定量的补骨脂乙素对照品,按上述同样方法测定峰面积,计算回收率。

1.4.4 精密度试验 将补骨脂粉末提取液按照“1.3.3”项下色谱条件连续进样6次分析,测峰面积并计算相对标准偏差(RSD),得日内精密度;同样的方法每天连续进样3次,共进样3天,记录峰面积并计算RSD值,得日间精密度。

1.4.5 重复性试验 按照“1.3.1”项下方法将6份质量相同的补骨脂粉末制备成供试品溶液,并按照“1.3.3”项下色谱条件进行分析,记录峰面积并计算RSD值。

1.4.6 稳定性试验 按照“1.3.3”项下的色谱条件将补骨脂粉末提取液分别于0、2、4、8、12、24、36、48 h 进行分析,记录峰面积并计算RSD值。

1.4.7 单因素试验 (1)料液比对补骨脂乙素提取工艺的影响。固定碱液浓度为1%,碱提时间为1 h,酸沉pH为5,酸沉时间为1 h,超声时间为10 min的条件保持不变,改变料液比例分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25进行试验,以补骨脂乙素含量为指标,高效液相色谱法进样分析,记录峰面积。(2)碱液浓度对补骨脂乙素提取工艺的影响。固定料液比为1∶5,碱提时间为1 h,酸沉pH为5,酸沉时间为1 h,超声时间为10 min的条件保持不变,改变碱液浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%进行试验。(3)碱提时间对补骨脂乙素提取工艺的影响。固定料液比为1∶5,碱液浓度为1%,酸沉pH为5,酸沉时间为1 h,超声时间为10 min的条件保持不变,改变碱提时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5 h进行试验。(4)酸沉pH对补骨脂乙素提取工艺的影响。固定料液比为1∶5,碱液浓度为1%,碱提时间为1 h,酸沉时间为1 h,超声时间为10 min的条件保持不变,改变酸沉pH分别为 3、4、5、6进行试验。(5)酸沉时间对补骨脂乙素提取工艺的影响。 固定料液比为1∶5,碱液浓度为1%,碱提时间为1 h,酸沉pH为 5,超声时间为10 min的条件保持不变,改变酸沉时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5 h进行试验。(6)超声时间对补骨脂乙素提取工艺的影响。固定料液比为1∶5,碱液浓度为1%,碱提时间为1 h,酸沉pH为 5,酸沉时间为1 h的条件保持不变,改变超声时间分别为10、15、20、25、30 min进行试验。

1.5 正交试验 通过对单因素试验结果进行分析,以L9(34)的方式进行正交试验(见表1) 。

表1 正交试验因素水平

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性 由标准品可知补骨脂乙素的峰出现在24.4 min,其峰形良好,且分离度大于2,达到了基线分离的条件,专属性良好(见图1)。

2.1.2 线性相关性试验 将补骨脂乙素峰面积作为纵坐标,浓度作为横坐标绘制标准曲线,曲线方程为Y=24 683X+11 0191,R=0.999 7,其中Y表示补骨脂乙素峰面积,X表示浓度(μg/mL),试验结果表明,实验中补骨脂乙素在2.50～640.00 μg/mL呈现良好的线性关系。

2.1.3 精密度试验 按照“1.3.1”项下方法制备供试品溶液,连续测定6次,得日内精密度;每天测定3次,连续测定3 d,得日间精密度。由表2可知,日内精密度为0.99%,日间精密度为1.96%,两者RSD均小于2%,这表明仪器具有良好的精密度。

表2 补骨脂乙素的日内、日间精密度和准确度

2.1.4 回收率试验 对制备的6份供试品溶液按照“1.3.3”项下色谱条件进样分析,其平均回收率为110.88%,RSD为1.82%(见表3)。

表3 加样回收率试验结果(n=6)

2.1.5 稳定性试验 按照“1.3.3”项下色谱条件将配制好的供试品溶液进样分析,进样时间为0、2、4、8、12、24、36和48 h,RSD为1.52%,表明补骨脂乙素常温放置48 h内稳定性良好(见表4)。

表4 补骨脂乙素的稳定性试验结果

2.1.6 重复性试验 相同条件下,将补骨脂乙素粉末按照“1.3.1 ”项下方法制备成供试品溶液,并按照“1.3.3”项下色谱条件进样分析,重复6次,计算得其RSD为1.62%(n=6),该实验结果表明此方法的重复性良好(见表5)。

表5 补骨脂乙素的重复性试验结果

2.2 单因素试验 固定料液比1∶10,碱液浓度1%,碱提时间1 h,酸沉pH 5,酸沉时间1 h,超声时间10 min保持不变,依次改变上述条件中的单一条件进行单因素试验。碱提酸沉法提取补骨脂乙素的最佳条件为:料液比1∶10,碱液浓度3%,碱提时间2 h,酸沉pH6,酸沉时间2 h,超声时间25 min(见图2)。

2.3 正交试验 通过计算正交试验极差值可知,各因素所产生的影响由大到小顺序依次为:A碱液浓度,B酸沉时间,C超声时间;此外,不同水平对结果的影响分别为:A3>A2>A1;B1>B2>B3;C3>C2> C1(见表6) 。由正交试验方差分析结果可知,碱液浓度差异具有统计学意义(P<0.05)(见表7)。鉴于以上结果,优化组合为A3B1C3,即碱提酸沉法提取补骨脂乙素的最佳条件为碱液浓度4%、酸沉时间0.5 h、超声时间20 min。

表6 L9(34) 正交试验分析结果

3 讨论

中医近年在国际上影响力渐增,随着人们对于中药的研究越发深入,探究各类中药中的有效成分是近几年来的热点话题。目前已经报道的中药有效成分提取工艺有多种,例如:回流法、煎煮法、浸渍法、渗漉法和溶剂提取法等[13-14],这些方法都有其局限性,回流法和煎煮法会破坏受热易分解的成分;浸渍法、渗漉法效率低时间长;溶剂提取法虽然效率高、简单快捷,但毒性较大。

表7 L9(34) 正交试验方差分析结果

碱提酸沉法作为一种经济、环保、高效的提取方法,常用于黄酮类、蒽醌类、酚性、内酯结构的木脂素、香豆素类等化合物的提取分离[15-16]。补骨脂乙素是中药补骨脂中的查尔酮类活性成分,具有较高的药理活性。但其在补骨脂中的含量较低,不易被大量开发利用,因此,寻找一种最优的提取条件对其进行大量提取是非常有必要的。本研究针对补骨脂乙素酚羟基的酸性性质,通过碱提酸沉的方法优化提取条件,建立了一种简便、高效、重复性良好的补骨脂乙素碱提酸沉提取方法。

通过以补骨脂中补骨脂乙素含量为检测指标,采用高效液相色谱法测其含量,前期预实验中,考察了不同碱液氢氧化钠及碳酸钠对补骨脂乙素含量的影响,最终选择了提取含量较高的碳酸钠为最佳碱液;通过考察不同酸沉pH,发现酸性过强时沉淀消失,可能是沉淀出的化合物在强酸环境下生成盐复溶于酸中,而pH 3～6范围内对补骨脂乙素含量影响较小,考虑到生产成本,选择pH 6为最佳酸沉pH。

为进一步确认提取的最佳条件,根据单因素试验结果,选择碱液浓度、酸沉时间以及超声时间三个水平进行正交试验。本实验通过对正交试验的结果进行方差分析,以弥补其不能准确估计直观分析结果对试验的误差及各因素作用的缺陷。根据单因素试验与正交试验结果,考虑到补骨脂乙素的生产成本以及提取效率等因素,我们确定碱提酸沉法提取补骨脂乙素的最佳工艺条件为:料液比1∶10,碱液浓度4%,碱提时间2 h,酸沉pH 6,酸沉时间0.5 h,超声时间20 min。

本研究通过碱提酸沉的方法对补骨脂中的补骨脂乙素提取工艺进行优化,其方法稳定可靠、操作简便,重现性好,适合补骨脂乙素的大量提取。