精氨酸代琥珀酸合成酶-1对胰岛β细胞增殖与凋亡的影响

夏芷晴，张紫晨，付麒，何云强，杨涛，孙敏*

1南京医科大学第一附属医院内分泌科，江苏 南京 210029；2盐城市第三人民医院内分泌科，江苏 盐城 224000

糖尿病是一种高患病率的代谢性疾病，以胰岛损伤和胰岛功能障碍为特征［1］。胰岛由β细胞、α细胞、δ细胞、PP 细胞和ε细胞组成，分别分泌胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等物质维持机体糖稳态。其中，胰岛β细胞占胰岛细胞的50%～80%［2］，分泌具有强烈降血糖的胰岛素。因此，如何增加胰岛β细胞数量和保护胰岛β细胞功能是糖尿病治疗的重要研究方向。精氨酸代琥珀酸合成酶-1（argininosuccinate synthetase 1，ASS1）是尿素循环中的限制酶，可催化瓜氨酸和天冬氨酸缩合形成精氨酸的直接前体——精氨酸代琥珀酸，后者可转化为精氨酸并生成NO 和L-瓜氨酸，是NO 合成的潜在限速步骤［3］。本课题组前期研究发现模拟2 型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM）发病过程的高脂喂养鼠胰岛ASS1 mRNA 平均表达量较正常对照组降低［4］，与其他团队发现的高脂喂养鼠胰岛ASS1 蛋白表达量较对照组降低一致［5］。研究发现在促炎因子干扰素（interferon，IFN）-γ、白介素（interleukin，IL）-1β和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α干预下，增加丙酮酸羧化酶活性可促进三羧酸循环生成更多的天冬氨酸，天冬氨酸在ASS1催化下与瓜氨酸反应生成精氨基琥珀酸，促进精氨酸生成尿素，减少NO生成，减轻IFN-γ、IL-1β和TNF-α对胰岛β细胞的损伤［6］。亦有研究发现高表达ASS1可减少棕榈酸诱导的胰岛β细胞凋亡和减轻β细胞功能障碍［7］。目前有关ASS1的研究主要在炎症、脂毒性等病理环境下进行，有关ASS1在生理条件下对胰岛β细胞的研究尚需完善，故本研究旨在评估ASS1生理条件下表达量的高低对胰岛β细胞增殖、凋亡的影响，并探索其潜在的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠胰岛素瘤β-TC6细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。胎牛血清、0.25%EDTA-胰酶（Gibco公司，美国）；DMEM高糖培养基、青链霉素混合液、RIPA 裂解液、嘌呤霉素、Alexa Fluor647/PI 凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司，美国）；ASS1-siRNA（广州锐博生物科技有限公司），慢病毒载体（上海汉恒生物科技有限公司）；Trizol（Thermo Fisher 公司，美国）；增强型BCA 蛋白浓度测定试剂盒、羊抗兔IgG-HRP 抗体、羊抗鼠IgG-HRP 抗体（上海碧云天生物技术有限公司）；PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TaKaRa 公司，日本）；Caspase-3 抗体、凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）抗体、β-actin 抗体（CST 公司，美国）；Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体、B 细胞淋巴瘤-2（B-cell leukaemia-2，Bcl-2）蛋白抗体、ASS1抗体、细胞核增殖抗原（Ki67）抗体和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian rapamycin target protein，mTOR）抗体（Abcam 公司，美国）；TUNEL凋亡检测试剂盒（苏州宇恒生物科技有限公司），EdU细胞增殖检测试剂盒（广州锐博生物科技有限公司），CCK-8试剂盒（MCE公司，美国）；荧光定量PCR 仪（Roche 公司，美国），流式细胞仪（BD公司，美国），酶标仪（Thermo Fisher公司，美国），荧光显微镜（ZEISS公司，德国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

β-TC6细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的高糖DMEM完全培养基，在含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 siRNA敲低ASS1

ASS1 的siRNA 序列为5′-CTACAAAAGTGGTCATCCA-3′。采用Lipofectamine3000并根据说明书转染β-TC6 细胞，实验分为Blank 组、si-NC 组、si-ASS1 组。细胞提前1 d 种于6 孔板中，待细胞生长融合度达40%时进行转染。用Opti-MEM 培养基稀释Lipofectamine3000，与含siRNA 的Opti-MEM 培养基混匀后室温静置15 min，用Opti-MEM 培养基和β-TC6完全培养基按9∶1比例补足反应体系后加入6 孔板中，24 h 后更换培养基，48 h 后收集细胞进行相关实验。

1.2.3 慢病毒过表达ASS1

采用慢病毒载体构建ASS1过表达稳转细胞株，实验分为Blank组、OE-NC组、OE-ASS1组。细胞提前1 d种于25 cm2细胞培养瓶中，24 h后更换培养基为2.5 mL含病毒的β-TC6完全培养基，4 h后补足培养基至5 mL。转染24 h后，每24 h 更换新鲜培养基。细胞生长至70%融合度时进行传代。传代后用含4 μg/mL嘌呤霉素的β-TC6完全培养基筛选稳转株。

1.2.4 qRT-PCR检测

用Trizol 提取细胞总RNA，测量浓度后取500 ng RNA 逆转录合成cDNA。cDNA 用DEPC 水1∶5 稀释后，根据SYBR Green Realtime PCR Master Mix qPCR 说明书冰上制备PCR 反应液，在StepOne-Plus 实时荧光定量PCR 仪器上进行实时荧光定量PCR 反应，95 ℃10 s 预变性；95 ℃5 s、60 ℃1 min，40个循环；95 ℃15 s、60 ℃1 min、15 ℃1 s。以空白对照组为内参，目的基因相对表达量以ΔCT表达。

1.2.5 Western blot检测

RIPA 裂解液冰上提取细胞蛋白，用增强型BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白煮沸变性后，取30 μg样品进行10%SDS-PAGE凝胶电泳2 h，湿转法将蛋白转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，加入一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗涤后加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤后ECL发光液显影，凝胶成像仪曝光蛋白条带。

1.2.6 CCK-8实验

将β-TC6 细胞按3×104个/孔接种于96 孔板中，给予处理后更换新鲜培养基，每孔加入10 μL CCK-8检测液，于培养箱中孵育1.5 h，用酶标仪在450 nm波长测每孔吸光度，计算细胞增殖活力。细胞活力=（A干预-A空白）/（A对照-A空白）×100%（A干预：含细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度值；A空白：含培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度值；A对照：含细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度值）。

1.2.7 5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）法检测细胞增殖

β-TC6 细胞按3×104个/孔接种于96 孔板中，给予处理后更换为含50 μmol/L EdU 的完全培养基，于培养箱中孵育2 h，PBS 洗涤后，用4%多聚甲醛室温固定30 min，0.5%的Tritonx-100 于摇床上孵育10 min，PBS 洗涤后，加入Apollo 染色反应液室温避光孵育30 min，0.5%的Tritonx-100清洗后，甲醇清洗1次，PBS洗涤后用荧光显微镜拍照观察。

1.2.8 AV/PI检测

收集干预后的全部细胞至离心管中，PBS 清洗后，加入195 μL Annexin V-Alexa Fluor 647结合液重悬细胞并转移至流式管中，每管加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 647，混匀后4 ℃孵育15 min。避光每管加入5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液后，立即用流式细胞仪检测。

1.2.9 TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（terminal dUTP nick-end labeling assay，TUNEL）检测细胞凋亡

β-TC6 细胞按3×104个/孔接种于96 孔板中，给予处理后，PBS洗涤2次，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛于4 ℃固定30 min，PBS 洗涤后，0.2%TritonX-100室温孵育20 min，PBS洗涤后，TUNEL平衡缓冲液孵育5 min，弃去缓冲液，加50 μL TUNEL 反应混合液37 ℃避光反应1 h，PBS洗涤后，每孔加入30 μL DAPI室温孵育10 min，PBS洗涤后加入甘油封片，避光用倒置荧光显微镜拍照。

1.3 统计学方法

所有样本均独立重复3次。采用SPSS 26.0软件分析统计所得数据，用均数±标准差（）表示。独立样本t检验用于两组数据间比较，多组比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-TC6 细胞中ASS1 敲低和过表达体系的构建及验证

将si-ASS1 和si-NC 转染到β-TC6 细胞48 h 后（转染效率约80%），收集细胞检测ASS1 mRNA和蛋白表达水平。结果显示，转染si-ASS1 的细胞中，ASS1 mRNA和蛋白水平明显降低（图1A～C）。

图1 β-TC6细胞中ASS1敲低和过表达体系的构建及验证Figure 1 Verification of ASS1 expression in β-TC6 cells after knockdown and overexpression of ASS1

采用慢病毒载体构建ASS1过表达稳转株后，收集细胞检测ASS1 mRNA 和蛋白表达水平。结果显示，ASS1过表达细胞中，ASS1 mRNA 和蛋白水平显著升高（图1D～F）。

2.2 ASS1低表达和高表达对β-TC6细胞增殖的影响

与si-NC 组比较，敲低ASS1 后β-TC6 细胞EdU阳性细胞率减少（P＜0.05，图2A、B），细胞增殖活力下降（P＜0.05，图2C）。与OE-NC 组比较，过表达ASS1 后β-TC6 细胞EdU 阳性细胞率和细胞增殖活力无明显差异（图3）。

图2 si-ASS1转染β-TC6细胞后细胞增殖变化Figure 2 Proliferation changes of β-TC6 cells after si-ASS1 transfection

图3 ASS1过表达载体转染后β-TC6细胞增殖变化Figure 3 Proliferation changes of β-TC6 cells transfected with ASS1 overexpression vector

2.3 ASS1低表达和高表达对β-TC6细胞凋亡的影响

与si-NC组比较，敲低ASS1后β-TC6细胞TUNEL阳性细胞率和凋亡细胞比例明显增加（P＜0.05，图4）。与OE-NC 比较，过表达ASS1 后β-TC6 细胞TUNEL 阳性细胞率和凋亡细胞比例下降（P＜0.01，图5）。上调ASS1可抑制β-TC6细胞凋亡。

图4 si-ASS1转染β-TC6细胞后细胞凋亡变化Figure 4 Changes of pancreatic β-TC6 cell apoptosis after si-ASS1 transfection

图5 ASS1过表达载体转染后β-TC6细胞凋亡变化Figure 5 Changes of apoptosis of β-TC6 cells transfected with ASS1 overexpression vector

2.4 ASS1低表达对β-TC6细胞中AIF信号通路影响

为了探究ASS1 对β-TC6 细胞增殖和凋亡作用的具体靶点，进一步研究发现，与si-NC 组比较，敲低ASS1 后β-TC6 细胞Bax/Bcl-2 比值降低（P＜0.001，图6A、B），cleaved Caspase-3/Caspase-3比值也降低（P＜0.01，图6C、D）。同时，与si-NC组比较，si-ASS1 组AIF 的mRNA 和蛋白水平增加（P＜0.01，图6E～G）。下调ASS1 增加β-TC6 细胞凋亡且不依赖Caspase途径，可能与AIF途径有关。

图6 si-ASS1转染β-TC6细胞后Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3和AIF的表达变化Figure 6 Expression changes of Bax/Bcl-2，cleaved Caspase-3/Caspase-3 and AIF in β-TC6 cells after si-ASS1 transfection

2.5 ASS1 高表达对β-TC6 细胞中mTOR 信号通路影响

与OE-NC 组比较，过表达ASS1 后β-TC6 细胞Ki67 和mTOR 的mRNA 和蛋白水平均升高（P＜0.001，图7）。上调ASS1 促进β-TC6 细胞存活可能与mTOR通路有关。

图7 ASS1过表达载体转染胰岛β细胞后Ki67和mTOR表达变化Figure 7 Expression changes of Ki67 and mTOR in pancreatic islet β cells transfected with ASS1 overexpression vector

3 讨论

ASS1是尿素循环中的限制酶，在肝脏和肾脏组织中高表达。临床研究发现肥胖人群外周血单核细胞中ASS1 表达较正常人降低，并且ASS1 的表达与体重指数和脂肪重量呈负相关［8］，这与高脂喂养小鼠胰岛中ASS1 的变化一致。既往研究结果显示IL-1β、TNF-α及IFN-γ联合处理下，大鼠胰岛β细胞和人胰岛细胞团ASS1 和iNOS 表达水平升高，同时给予生理浓度的精氨酸或瓜氨酸时，胰岛细胞可以生成更多的NO，后者进一步促进胰岛β细胞凋亡，损害胰岛β细胞［9］。除了ASS1，研究发现胰岛β细胞中也存在精氨基琥珀酸裂解酶、氨甲酰磷酸合成酶1、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶-2、N-乙酰谷氨酸合酶，胰岛中β细胞存在完整的尿素循环。在IL-1β、TNF-α和IFN-γ联合处理胰岛β细胞模拟炎症环境时，促进精氨酸代谢生成尿素，减少精氨酸生成NO，可减轻胰岛β细胞凋亡［6］。本研究发现生理条件下敲低ASS1后胰岛β细胞凋亡率增加，增殖水平下降，而高表达ASS1 后胰岛β细胞凋亡率减少，增殖水平增加。这提示ASS1对胰岛β细胞生存和功能发挥保护作用。

mTOR 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可感知细胞外营养状态和细胞内ATP 水平，对维持细胞生长和促进细胞增殖发挥重要作用［10］。Ki67 通常被认为是细胞增殖的标志物［11］。研究发现精氨酸可通过溶质载体（solute carrier，SLC）中溶酶体SLC38A9 激活mTOR信号通路［12］。本研究中高表达ASS1后，胰岛β细胞存活数量增加，Ki67 和mTOR 表达增加。因此，ASS1 可能通过mTOR 通路促进胰岛β细胞增殖，这与既往研究中降低胃癌细胞ASS1表达会抑制癌细胞增殖，而高表达ASS1可以通过激活mTOR信号通路促进肿瘤细胞存活具有一致性［13］。此外，研究报道L-精氨酸可改善糖尿病鼠胰岛β细胞功能障碍，促进胰岛β细胞恢复［14-15］。本研究仍需完善相关实验，明确精氨酸是否发挥作用。

细胞亲凋亡蛋白Bax 和亲生存蛋白Bcl-2，这一对蛋白在线粒体介导的依赖Caspase 凋亡通路中起重要作用［16］，通常用Bax/Bcl-2的比值反映细胞凋亡的趋势。Caspase-3 是细胞凋亡经典信号通路的下游执行分子，凋亡早期Caspase-3 活性增加，凋亡晚期Caspase-3 活性降低［17］。本研究使用TUNEL 和AV/PI 法检测细胞凋亡情况，检测的是凋亡晚期细胞［18］。因此，敲低胰岛β细胞ASS1后，Caspase-3 活性降低可能是细胞凋亡的伴随现象。正常生理状态下AIF 在线粒体内参与细胞的氧化磷酸化，当细胞受到特定损伤时，AIF 能够从线粒体转移到细胞核内直接诱导DNA降解而使细胞凋亡［19-20］。本研究发现敲低胰岛β细胞ASS1后，AIF在mRNA水平和蛋白水平的表达明显升高。因此，推测ASS1可能通过非经典Caspase途径介导了胰岛细胞凋亡的发生［21］，其中AIF 可能发挥重要作用，但仍需要进一步研究进行验证。

综上所述，本研究初步发现ASS1可促进胰岛β细胞增殖，这可能与激活mTOR 信号通路有关；而ASS1表达抑制时，胰岛β细胞可能通过AIF途径启动细胞凋亡。但ASS1促进增殖、抑制凋亡的保护作用是否与精氨酸及其他通路相关尚未明确，仍需进一步深入研究。ASS1是否能够成为保护胰岛β细胞功能的候选调控靶点，也需要整体水平的研究进一步探索。