贵粤皖沪4省(市)葡萄病害调查及病原初步鉴定

陈 晨,廖佳兴,牛亚捷,王 琦

(中国农业大学植物保护学院,北京,100193)

葡萄Vitisvinifera为葡萄科葡萄属植物,在我国栽种历史悠久。据统计,中国已成为全球第二大葡萄种植国[1-2]。安徽省适宜葡萄生长,2016年葡萄种植面积达2.1万hm2,年产量48.32万t,且在不断增加[3]。贵州省是我国西南葡萄产区的重要组成部分,2020年葡萄种植面积达3.39万hm2,产量约52.7万t[4]。上海市葡萄种植面积约3 333 hm2[5],广东省葡萄栽培面积4 000 hm2[6]。随着我国葡萄种植面积逐年增加,加之侵染性病害对葡萄产业的直接影响,葡萄病害成为制约我国葡萄产业发展的主要限制因素之一[7-8]。目前国内外报道的葡萄相关病害多达40多种,其中真菌性病害30多种,为害严重或较重的病害16种,细菌性病害2种,病毒性病害5种[8]。葡萄病害主要有炭疽病、霜霉病、灰霉病、溃疡病、白粉病和酸腐病等,能引起葡萄病害的病原种类多样,因此,对葡萄产区的主要病害及病原种类进行调查研究对于病害防治十分必要。有学者报道,贵州葡萄产区有葡萄黑斑病、炭疽病、黑痘病、灰霉病、霜霉病和白粉病的发生[9]。也有报道青霉菌、炭疽病菌和链格孢菌在贵州为害葡萄[10]。上海有葡萄霜霉病、白粉病、灰霉病、炭疽病等病害的发生[5]。广东有白粉病、溃疡病、霜霉病、穗轴褐枯病、灰霉病等病害为害葡萄的报道[11]。由于病害发生种类与为害严重程度与栽培品种及栽培措施关系较大,为给现阶段葡萄生产的病害防治提供依据,很有必要进行再调查。因此,笔者选择贵州、广东、安徽、上海的葡萄主产区进行主要病害的联合调查,并就安徽、贵州和广东省的葡萄主要种植区进行葡萄病原物分离纯化和ITS的初步鉴定,为今后4省(市)的葡萄病害综合防治提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 调查地点

2021年7—8月在广东、贵州、安徽省和上海市进行葡萄病害调查,共计调查66个点位。同年8—9月在广东、贵州、安徽省进行葡萄病样的采集,以对葡萄病害病原种类进行调查。详细的病害样本信息见表1。

表1 葡萄病害样本调查采集信息统计

1.2 试验方法

1.2.1 病害调查 采用五点取样调查法[12]。在果园对角线中心选取1点,围绕该点为中心等距的四角各选择1点,每点分别选择20穗葡萄进行调查,共100穗,调查各病害的发生情况,并利用公式分别计算其发病率和病情指数。果实病害分级标准[13]:0级,整穗健康无发病;1级,病果面积占整个果穗面积的5%以下;3级,病果面积占整个果穗面积的6%～15%;5级,病果面积占整个果穗面积的16%～25%;7级,病果面积占整个果穗面积的26%～50%;9级,病果面积占整个果穗面积的51%以上。叶部病害同样参照五点取样,每点5株,随机选择20片叶,共调查100片,进行各叶部病害发生情况的调查,并利用公式分别计算其发病率及病情指数。叶部病害分级标准:0级:无病斑;1级:病斑面积占整个叶面积的5%以下;3级:病斑面积占整个叶面积的6%～25%;5级:病斑面积占整个叶面积的26%～50%;7级:病斑面积占整个叶面积的51%～75%;9级:病斑面积占整个叶面积的76%以上。

1.2.2 葡萄病株的采集 选取发病初期的病果(叶、果梗),将其分别装入50 mL底部加入脱脂棉或吸水纸的离心管中,置于装有足量冰袋的泡沫箱暂存,并及时进行病原菌的分离纯化。

1.2.3 病原菌的分离纯化 参考组织分离法[14]对病原菌进行分离纯化。将病果(叶、果梗)在超净台中先用无菌水冲洗材料表面2～3次,用2%次氯酸钠溶液浸泡3 min进行表面消毒,再用灭菌后的镊子夹出放入75%乙醇中浸泡30 s,以无菌水清洗3次并用灭菌滤纸吸干组织材料残留水分,将消毒后的病样切取病健交界处部分组织,放至PDA培养基平板中央,在25 ℃培养箱中倒置培养3～4 d,挑取菌落边缘菌丝于新的PDA培养基上,如此重复直至获得菌种单一的纯培养物。将纯化后的菌株转至PDA 斜面4 ℃保存,或取菌饼放入灭菌石蜡油4 ℃封存,保存备用。

1.2.4 病原菌的分子鉴定 将分离纯化后获得的病原菌菌丝体利用CTAB 法[15]提取真菌DNA,再利用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA质量后将其稀释作为PCR反应体系的扩增模板。用真菌18s rRNA 通用引物[16]ITSI 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和 ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’进行PCR 扩增。扩增体系:模板DNA 1 μL、ITS1 0.5 μL、ITS4 0.5 μL,Mix12.5 μL、水10.5 μL。扩增程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃,30 s;56 ℃,30 s;72 ℃,延伸1 min,35个循环;72 ℃,延伸10 min。PCR 产物送北京擎科生物科技有限公司进行纯化及测序。获得测序结果后在NCBI网站进行Blast比对,将病原菌鉴定到属水平并进行病原种类统计。

1.3 统计分析

采用Excel 2016进行数据处理及制图,数据采用“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 贵州和广东两省病害调查结果

广东省葡萄病害包括溃疡病、霜霉病、炭疽病、白腐病、黑痘病、白粉病、煤污病和灰霉病,其中溃疡病发生普遍(见表2)。葡萄溃疡病在广州、韶关、南雄和惠州等市均有发生,其中在乐昌市、惠州市发生较多且为害严重;炭疽病在南雄市、惠州市均有发生,惠东县“阳光玫瑰”的病果率高达77%;白粉病在惠州市3个果园有发生,发病率分别是97.6%、66.96%和27.02%;黑痘病仅在乐昌市“紫秋”葡萄上发现,病果率为52%;白腐病仅在南雄市发生,病果率为21.71%;煤污病仅在惠州市“阳光玫瑰”葡萄上发现,病叶率达65.32%。

表2 广东省葡萄病害调查结果

贵州省有霜霉病、灰霉病、炭疽病的发生(见表3)。葡萄霜霉病发生严重,在都匀市、福泉市、贵定县、贵阳市均有为害,其中在福泉市、贵定县、息烽县的发病率多在90%以上,为害严重;葡萄炭疽病仅为害水晶葡萄,不同葡萄园发病率存在较大差异,息烽县的炭疽病发病率均在70%以上,都匀市炭疽病发病率仅有11.79%;灰霉病只在息烽县葡萄园出现,在“夏黑”“摩尔多瓦”和“巨峰”葡萄上均有发生。

表3 贵州省葡萄病害调查结果

2.2 安徽和上海两地葡萄病害调查结果

安徽省有葡萄酸腐病、炭疽病、灰霉病、白腐病、黑曲霉病(见表4)。其中安徽省合肥市酸腐病发生较严重,巢湖市“夏黑”葡萄酸腐病发病率高达97.0%。葡萄炭疽病发病率均在10%以下。葡萄灰霉病仅在安徽省合肥市内有发生,其中巢湖市“巨峰”葡萄灰霉病发病率高达63.0%。葡萄白腐病在合肥市、六安市均有发现,且在“摩尔多瓦”“巨峰”“阳光玫瑰”3个葡萄品种上均有为害。葡萄黑曲霉病在六安市、合肥市有发现。

上海市发现了葡萄酸腐病、炭疽病和葡萄黑曲霉病(见表5),但由发病率及病情指数结果分析,总体葡萄病害的发生情况并不严重。奉贤区内“阳光玫瑰”的葡萄酸腐病较严重,发病率达48.3%,区内其余品种酸腐病零星发病,但发病率均在15%以下,病情指数也均低至2.0左右;浦东新区有少量病情发生;嘉定区未见酸腐病的发生。浦东新区及奉贤区有葡萄黑曲霉病的发生,其中,浦东新区“阳光玫瑰”葡萄发病率为53.3%;葡萄炭疽病发生不严重,发病率低于10%。

表5 上海市葡萄病害调查结果

2.3 3省市病原菌的分离鉴定结果分析

将分离获得的纯培养菌株通过基因组DNA提取以及ITS基因片段扩增进行初步鉴定,共鉴定了114株真菌(见表6)。广东省惠州市、广州市、韶关市分离的真菌有以下12个属:Alternariaspp. (链格孢属)、Botryosphaeriaspp. (葡萄座腔菌属)、Colletotrichumspp. (炭疽菌属)、Curvulariaspp. (弯孢属)、Diaporthespp. (间座壳属)、Fusariumspp. (镰孢菌属)、Lasiodiplodiaspp. (毛色二孢属)、Nigrosporaspp. (黑孢霉属)、Neofusicoccumspp. (新镰刀菌属)、Neopestalotiopsisspp. (新拟盘多毛孢属)、Phomopsisspp. (拟茎点霉属)和Rhizomucorspp. (根毛霉属)。

表6 广东等3省分离的菌株初步鉴定结果

贵州省的黔南州、贵阳市分离的真菌有8个属:Alternariaspp. (链格孢属)、Botrytisspp. (葡萄孢属)、Colletotrichumspp. (炭疽菌属)、Didymellaspp. (亚隔孢壳属)、Diaporthespp. (间座壳属)、Fusariumspp. (镰孢菌属)、Neopestalotiopsisspp. (新拟盘多毛孢属)和Trichodermaspp. (木霉属)。

安徽省的合肥市和六安市分离的真菌有Colletotrichumspp. (炭疽菌属)。

3 讨论与结论

经病害调查发现,广东、贵州、安徽均有葡萄霜霉病、炭疽病发生。其中广东省葡萄主要病害包括溃疡病、炭疽病、白粉病和白腐病,其中霜霉病发生最普遍,其次是炭疽病。贵州省葡萄主要病害包括霜霉病、炭疽病和灰霉病,其中葡萄霜霉病普遍发生,调查发现,避雨栽培能在一定程度上降低其发病率;炭疽病菌只为害水晶葡萄,且套袋处理的葡萄炭疽病的发病率低于不套袋。高永彬在2018年的调查发现,黔南州水晶葡萄的主要病害包括炭疽病、灰霉病、白粉病、黑痘病和霜霉病[9],本文在水晶葡萄上并没有发现灰霉病、白粉病和黑痘病。谭德龙等人在2016—2019年对广东省的设施葡萄病害发生情况进行调查,发现该省的主要病害是白粉病、霜霉病、穗轴褐枯病、溃疡病、灰霉病、日灼病、气灼病、毛毡病[11],而本文仅发现了白粉病、霜霉病、溃疡病、炭疽病,推测可能与调查样本量有关。安徽省葡萄病害有酸腐病、炭疽病、灰霉病、白腐病、黑曲霉病,其中酸腐病发生较严重。套袋可以有效减轻病害的发生,也有助于减轻葡萄灰霉病的发生。葡萄酸腐病是由酵母菌、病原细菌和真菌等微生物引起的复合侵染,还包括媒介昆虫的再侵染传播[18]。上海市葡萄病害的调查发现葡萄酸腐病、炭疽病和葡萄黑曲霉病,但病害发生情况并不严重,这与病害调查时间有关。

本研究共计分离纯化获得114株真菌。其中广东省初步鉴定的葡萄病原菌涉及12个属,主要有Alternariaspp. (链格孢属)、Botryosphaeriaspp. (葡萄座腔菌属)、Colletotrichumspp. (炭疽菌属)等。贵州省分离的病原菌涉及8个属,主要病原属有Alternariaspp. (链格孢属)、Botrytisspp. (葡萄孢属)、Botryosphaeriaspp. (葡萄座腔菌属)、Colletotrichumspp. (炭疽菌属)等。安徽省葡萄分离到的有Colletotrichumspp. (炭疽菌属)。其中,Colletotrichumspp.是葡萄炭疽病的病原菌;Fusariumspp.被报道能够导致葡萄果实腐烂[19];Alternariaspp.是葡萄穗轴褐枯病的病原菌,主要为害葡萄果穗幼嫩的穗轴组织[20];Neopestalotiopsisspp.能导致葡萄腐烂和枝干病害的发生[21];Botryosphaeriaspp.主要引起葡萄枝干病害,是葡萄溃疡病的病原菌[22];Diaporthespp.是引起葡萄蔓枯病的主要病原菌[23];Botrytisspp.是灰霉病的主要病原菌[24];Curvulariaspp.被报道是引起葡萄叶斑病的病原菌[25];Lasiodiplodiaspp.能够导致葡萄枝干病害的发生,是葡萄溃疡病的病原菌[26]。本研究仅扩增了分离物的ITS基因片段,若想进一步明确其分类地位,还需要结合形态学以及多基因系统发育分析等多种手段。此外,本试验所分离的真菌其致病力有待进一步分析。