贵州百香果果实炭疽病病原菌分离及鉴定

赵晓珍,王 红,王红林,解 璞,马玉华

(贵州省农业科学院果树科学研究所,贵阳,550006)

百香果PassifloraedulisSims又名西番莲、鸡蛋果,属西番莲科(Passifloraceae)西番莲属,原产于南美洲,主要种植于热带和亚热带地区,在我国广东、广西、福建、台湾、贵州、四川等地均有种植[1]。百香果富含维生素、氨基酸、矿质元素、膳食纤维等营养物质,以及黄酮、类胡萝卜素、多糖等生物活性成分,深受消费者喜爱[2-3]。贵州省百香果产业主要集中在黔东南苗族侗族自治州、黔西南布依族苗族自治州、黔南布依族苗族自治州等地区,近年来发展迅速,种植面积已超1.07万hm2,居全国第三[4]。随着贵州省百香果种植面积快速增加,且种植区域夏季高温多雨,病害问题日趋严重。目前我国百香果主要病害有病毒病、炭疽病、茎基腐病、果腐病、疮痂病等[5-9],在贵州、广西等地百香果炭疽病发生较为普遍[10-11]。百香果炭疽病主要为害果实,发病初期为褪绿黄色小点,逐步扩大为黄色病斑,圆形或不规则形,严重时病斑连片,后期病斑上会散生黑色小点,严重影响百香果的商品果率和产量。百香果炭疽病病原种类多,目前国内外已报道病原主要有巴西炭疽菌Colletotrichumbrasiliense[11]、博宁炭疽菌C.boninense[12-13]、短孢炭疽菌C.brevisporum[14]、胶孢炭疽菌C.gloesporioides[15]等,冉飞等[10]报道贵州百香果炭疽病原为喀斯特炭疽菌C.karstii。同一植物上的炭疽病可能由不同种类炭疽菌引起,而不同种类炭疽菌对同种杀菌剂的敏感性可能存在显著性差异[16-18],因此,明确贵州百香果炭疽病病原是防治病害的关键。本研究通过病原菌形态学、致病性和分子生物学鉴定,明确贵州百香果炭疽病病原,为贵州百香果炭疽病防治,以及百香果抗性育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

贵州省果树科学研究所热带果树种植基地(贵州省安顺市镇宁布依族苗族自治县坝草镇)采集“紫香1号”百香果炭疽病典型症状病果及健康果实备用。

1.2 病原菌的分离和纯化

采用常规组织分离法[19],在病果表面病健交界处取约为3 mm×3 mm大小组织,依次用75%酒精浸泡3 s,5%次氯酸钠溶液浸泡4～5 min,灭菌水洗4～5次,灭菌滤纸干燥后置于PDA培养基,25 ℃恒温培养,待组织周围长出菌落,挑取菌落边缘菌丝纯化,纯化菌株接种于PDA斜面4 ℃保存备用。

1.3 致病性测定

将分离纯化菌株于PDA培养基上28 ℃培养7 d,用直径5 mm无菌打孔器取菌饼,采用针刺法[19-20]将菌饼接种于健康果实上,以接种无菌PDA培养基块果实作为对照,无菌脱脂棉保湿,分别于28 ℃和22 ℃,相对湿度75%光照培养箱培养12 h,重复3次,5 d后观察发病情况,并对发病百香果再次分离鉴定。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 形态学鉴定 将纯化后致病菌株接种于PDA培养基,28 ℃培养5 d后,用显微镜观察菌丝等形态。

1.4.2 分子生物学鉴定 采用Ezup柱式真菌基因组DAN试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司产)提取致病菌DNA,对内转录间隔区基因(internal transcribed spacer gene,ITS)、肌动蛋白基因(actin gene,ACT)、β-微管蛋白基因(beta-tubulin gene,TUB2)、几丁质合成酶A基因(chitin synthase A gene,CHS-1)进行扩增[21-23]。PCR产物纯化,克隆后送北京擎科生物科技有限公司测序。将测序结果进行比对分析,并参考Cannon等[24]报道的相关模式菌株序列,采用MAGA6.0经比对校正,按ITS、TUB2、ACT、CHS-1顺序拼接后,以甘薯黑痣病菌Monilochaetesinfuscans为外群,运用Maximum Likelihood构建进化树(见表1)。

表1 用于构建百香果果实炭疽病病原菌进化树的GenBank登录号

2 结果与分析

2.1 百香果果实炭疽病症状

从图1可以看出,发病初期为褪绿黄色小点,逐步扩大为黄色病斑,圆形或不规则形,稍凹陷;严重时病斑连片,布满整个果实,后期病斑上会散生黑色小点。

图1 百香果田间果实炭疽病症状和分离菌株B10和ZB3致病性测定

2.2 病原分离及致病性测定

从图1可以看出,分离纯化菌株B10和ZB3分别接种健康果实5 d后,接种部位均有明显黄色病斑,与田间症状相似,对照未见明显病斑。根据柯赫氏法则对接种后发病果实进行分离,并观察菌落、孢子形态等与菌株B10、ZB3一致,表明分离菌株B10、ZB3均可引起果实炭疽病。

2.3 病原菌鉴定

2.3.1 病原菌形态特征 从图2可以看出,菌株B10在PDA培养基上菌落圆形,边缘整齐,正面为白色气生菌丝,培养5 d后,菌落直径可达4.9 cm,部分产生桔红色分生孢子堆,反面因受分生孢子堆影响呈黄白色。菌株B10分生孢子透明,单孢,椭圆形、长椭圆形,一端钝圆,另一端钝圆或稍尖,未见明显油球,大小(10～24) μm×(4.5～8.5) μm。菌株ZB3在PDA培养基上菌落圆形,边缘整齐,正面气生菌丝白色,培养5 d后,菌落直径可达5.1 cm,反面初期白色,随培养时间增加逐渐变为淡黄色至黄色。菌株ZB3分生孢子透明,单胞,椭圆形或长椭圆形,一端钝圆,另一端钝圆或稍尖,未见明显油滴,大小(10.5～19) μm×(5～7.5) μm。根据形态初步推断菌株B10和ZB3均为炭疽菌属(Colletotrichum)真菌。

图2 菌株B10和菌株ZB3在PDA培养基上菌落形态及其分生孢子形态

2.3.2 病原菌分子生物学鉴定 从图3可以看出,菌株B10与Colletotrichumbrasiliense(菌株CBS 128501,GenBank登陆号:ITS,JQ005235;TUB2,JQ005669;ACT,JQ005583;CHS-1,JQ005409),菌株ZB3与C.karstii(菌株CORCG6,GenBank登陆号:ITS,HM585409;TUB2,HM585428;ACT,HM581995;CHS-1,HM582023;菌株CZ2-2,ITS,MT351103;TUB2,MT396845;ACT,MT396749,CHS-1,MT396781)聚于一支,外群菌株处在系统发育树的外围。因此,结合形态学分析、致病性验证和多基因序列分析,推断引起贵州百香果果实炭疽病病原菌主要为巴西炭疽菌Colletotrichumbrasiliense和喀斯特炭疽菌C.karstii。

图3 基于ITS-TUB2-ACT-CHS-1基因序列构建的菌株B10和菌株ZB3系统发育树

3 结论与讨论

炭疽菌属(Colletotrichum)真菌是一类普遍存在的植物病原菌,可侵染果树、蔬菜、花卉等多类植物,主要造成植物表皮组织形成规则或不规则的坏死病斑,导致发病组织坏死,严重时造成植株死亡,引起严重的经济损失[24]。炭疽菌属传统分类鉴定主要依靠孢子,附着胞及菌落生长速率、颜色等形态特征,但由于炭疽菌随培养条件可变化,仅依靠形态不能有效地区分鉴定炭疽菌种类。在现代炭疽菌属分类中,多基因联合系统发育分析可有效鉴定炭疽菌属真菌种类[25-27]。

本研究结合形态学观察、致病性验证,以及ITS-TUB2-ACT-CHS-1多基因构建系统发育树,明确引起贵州百香果果实炭疽病的致病菌为巴西炭疽菌C.brasiliense和喀斯特炭疽菌C.karstii,与冉飞等[10]报道贵州百香果炭疽病病原C.karstii以及SHI等[11]报道广西百香果炭疽病病原C.brasiliense在孢子形态上较为一致,但菌落形态有差异,这可能与培养条件等有关。据报道博宁炭疽复合种[28]中的C.karstii[10]、C.Brasiliense[11]、C.boninense[12-13]、C.constrictum[29]以及胶孢炭疽复合种中的C.gloesporioides[15]等可引起百香果果实炭疽病。本研究结果表明,贵州产区百香果果实炭疽病可能同时由巴西炭疽菌C.brasiliense和喀斯特炭疽菌C.karstii复合侵染。目前关于百香果炭疽病防控药剂筛选研究较少,冉飞等[30]筛选了9种杀菌剂对百香果炭疽病C.karstii的抑菌效果,鲜见关于百香果炭疽病C.brasiliense药剂筛选的报道。同种植物炭疽病可由多种炭疽菌引起,不同炭疽菌种类对同种杀菌剂敏感性可能会有明显差异。如许媛等[16]报道江苏句容葡萄炭疽病至少有3个炭疽菌种群(C.aenima、C.viniferum、C.fructicola),且对多菌灵的抗药性不同;霍建飞等[17]报道戊唑醇对2种辣椒炭疽菌(C.truncatum、C.scovillei)敏感性差异明显;贺竟锋等[18]报道橡胶树不同种炭疽菌对杀菌剂的敏感性具有差异,并建议应先明确橡胶园病原菌种类再选择合适的药剂。因此,本研究中鉴定出的百香果果实炭疽病病原C.brasiliense和C.karstii对同种杀菌剂的敏感性可能不同,有待加强药剂筛选工作。