室内矿物油农药对柑桔木虱的驱避及对获取黄龙病菌的影响

陶通来,高 晶,杨琼玉,毛润乾,吴诗宝

(1 华南师范大学生命科学学院,广州,510631;2 广东省科学院动物研究所/广东省动物保护与资源利用重点实验室/广东省野生动物保护和利用公共实验室/广东省矿物油农药工程技术研究中心,广州,510260)

柑桔黄龙病(Hanglongbing,HLB)又称黄枯病、青果病、黄梢病,是柑桔最具毁灭性的病害之一。中国19个栽培柑桔的省区已经有11个遭受过柑桔黄龙病为害[1]。2005—2015年,黄龙病摧毁了美国佛罗里达州近4.05万hm2(10万英亩)的柑桔种植园,累计造成了超过29亿美元的损失[2-4]。黄龙病病原菌是一类专门寄生在柑桔韧皮部的革兰氏阴性细菌,属韧皮杆菌属细菌,到目前为止共发现3个种,即亚洲种(CandidatusLiberibacter asiantus,CLas)、美洲种(CandidatusLiberibacter americanus,CLam)和非洲种(CandidatusLiberibacter africanus,CLaf),其中CLas分布最为广泛,在我国流行的黄龙病病原也是该种细菌,柑桔黄龙病菌可通过柑桔木虱(DiaphorinacitriKuwayama)取食、嫁接、菟丝子寄生3种方式进行传播[5-7]。柑桔木虱,属于半翅目,木虱科,不完全变态发育,生长阶段分为卵、若虫、成虫,若虫和成虫可通过刺吸式口器吸食柑桔叶或嫩枝汁液,同时获得黄龙病病菌[8-10]。病菌一旦进入柑桔木虱体内,便会在其体内循环、扩散以及增殖,并且终身带毒,具有持久的传播能力[11]。因此,防治柑桔木虱,减少其传播黄龙病对维护柑桔产业安全至关重要。目前,防治柑桔木虱主要依赖化学防治,但长期大量使用化学农药会增加害虫的抗性,并且造成污染环境和引发食品安全问题,因而亟须寻找到一种绿色安全的防治办法。

矿物油农药是用矿物油基础油添加乳化剂等助剂生产而成,其通过在害虫虫体形成油膜,使害虫窒息死亡[12-14]。矿物油农药在柑桔害虫综合防控中应用广泛,对柑桔全爪螨(Panonychuscitri,俗称柑桔红蜘蛛)、柑桔矢尖蚧(Unaspisyanonensis)、柑桔小实蝇(Bactroceradorsalis)、柑桔粉虱(Dialeurodescitri)、柑桔潜叶蛾(Phyllocnistiscitrella)、柑桔粉蚧(Planococcuscitri)、绣线菊蚜(Aphisspiraecola)等有很好的防控作用[15-19]。此外,矿物油农药还可通过掩盖引诱型寄主植物的挥发物或诱导植物产生驱避性挥发物来驱避害虫[20],如烟粉虱(Bemisiatabaci)、长管蚜(Macrosiphumeuphorbiae)、桔小实蝇、土豆木虱(Bactericeracockerelli)等[21-23]。矿物油农药对柑桔木虱驱避作用方面的研究也有报道。Ouyang等[24]选择2株甜橙(Citrussinensis)分别喷洒矿物油农药和水,观察柑桔木虱对甜橙的选择性,结果表明多种矿物油农药对柑桔木虱有驱避作用。岑伊静等[25]采用四臂嗅觉仪研究发现,机油乳剂对柑桔木虱无驱避作用。可能是由于测试方法和矿物油农药不一致,导致两者的研究结果截然不同。因此,关于矿物油农药对柑桔木虱是否有驱避作用仍然需要进一步研究。

矿物油农药不仅影响昆虫存活和寄主选择,还可影响昆虫传播病害的能力。如:矿物油农药可使病毒失活,从而有效抑制桃蚜(Myzuspersicae)获得马铃薯Y病毒[26],以及可通过抑制马铃薯Y病毒黏附在樱桃燕麦蚜虫(Rhopalosiphumpadi)的口针上,从而抑制病毒的传播[27],矿物油农药可通过影响桃蚜的寄主选择行为从而抑制蚜虫传播李痘病毒[28-29]。在柑桔病害方面,矿物油农药对柑桔煤烟病的防治效果显著[30]。田间发现矿物油农药可显著降低黄龙病的感染率[31],但是矿物油农药如何影响黄龙病的发生,是否是通过影响柑桔木虱而干扰黄龙病的传播,仍未知。基于以上背景,本文研究了矿物油农药对柑桔木虱的驱避作用,以及矿物油农药对柑桔木虱获取柑桔黄龙病病菌的影响,希望能够为矿物油农药应用于柑桔黄龙病的治理提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用柑桔木虱采自中山大学南校区英东体育馆前的九里香植株,之后在温室[温度为(26±1) ℃,光照强度为6 000 lx,光周期为光照∶黑暗=14∶10,湿度为(70±5)%]饲养。

所用的黄龙病树为沙糖桔树,从德庆感染黄龙病的废弃柑桔园移栽至室内培养;所用的健康树,也为沙糖桔,来源于清远无病苗圃;九里香树购自广州岭南花卉市场,之后于温室中培养(条件同上);均使用盆栽培养,树体高度为20～30 cm。

所用矿物油农药为绿颖®99%矿物油乳油制剂,来自韩国SK株式会社,密度为0.834 2 g/cm3,平均正烷烃碳数当量23(nC23)。试验前将矿物油农药稀释至浓度为0.5%(体积分数)备用。

1.2 矿物油农药对柑桔木虱选择行为的影响

1.2.1 驱避作用 选取生长状态相似的九里香嫩梢,分别喷洒矿物油农药(处理组)及去离子水(对照组),1 h后测定柑桔木虱趋性的行为反应,采用Y型嗅觉仪测定柑桔木虱的行为反应。“Y”型管主臂通过硅胶管与真空抽气泵相连,“Y”型管的两臂通过硅胶管与味源瓶相连。一个味源瓶内加入矿物油农药处理过的九里香嫩梢,另一个味源瓶内加入去离子水处理过的九里香嫩梢或者不加任何样品(见图1)。在“Y”型管主臂管口接入20头经饥饿处理2 h的柑桔木虱成虫,待柑桔木虱苏醒后,打开真空抽气泵,观察记录柑桔木虱的选择,当其爬过某个测试臂1/3位置,并停留30 s以上则确定为选择该测试臂,反之则视为无响应。

图1 Y型嗅觉仪

1.2.2 驱避作用的持效性 选取生长状态相似的九里香嫩梢,分别喷洒矿物油农药和去离子水,待喷洒1 h、1 d、4 d和7 d后,采用Y型嗅觉仪进行行为反应测定,方法同上,计算驱避率。驱避率(%)=[(对照臂中虫数-处理臂中虫数)/(处理臂中虫数+对照臂中虫数)]×100%。

1.3 矿物油农药对柑桔木虱获取黄龙病病菌的影响

1.3.1 饲菌时长对柑桔木虱获菌率的影响 选取3株黄龙病沙糖桔树为3个重复,试验前参照Zheng等[32]和Li等[33]的方法检测黄龙病,结果为阳性。试验前将幼叶剪去,留下老叶,每株选取6个枝条,分别用带封口的透明网袋套袋后接15头不带黄龙病病菌的柑桔木虱,每株共接90头,让柑桔木虱分别在枝条上取食1、3、5、7、18和25 d。整个取食过程均在温室(条件同上)中进行。在每个取食时间节点取10头柑桔木虱,通过单头提取DNA检测是否获得黄龙病病菌,检测方法参照李翌菡等[34],计算其获菌率,以确定柑桔木虱在取食中获取黄龙病病菌的时间规律。获菌率(%)=(获菌柑桔木虱数量/供试柑桔木虱数量)×100%。

1.3.2 矿物油农药对柑桔木虱获取黄龙病病菌效率的影响 选取3株黄龙病沙糖桔树,每株选12个枝条供试,经检测每个枝条均带黄龙病病菌。对供试每个枝条标号,试验前将幼叶剪去,每个枝条留20片叶。每株黄龙病沙糖桔树先选取其中9个枝条分为3组(记为第1组、第2组和第3组),均喷洒矿物油农药至液滴开始往下滴即可;剩余3个枝条记为第4组,作为阳性对照,喷洒去离子水至液滴开始往下滴即可。每个供试枝条用1个带封口的透明网袋进行套袋。

选取3株健康沙糖桔树作为阴性对照,每株选3个枝条供试,经检测每个枝条均不带黄龙病病菌。试验前将供试枝条的幼叶剪去,每个枝条留20片叶后,均喷洒去离子水至液滴开始往下滴即可。每个枝条上用1个带封口的透明网袋套袋。

在每个透明网袋里接15头羽化3 d的不带黄龙病病菌的柑桔木虱成虫(饥饿处理24 h)。其中,第1组、第2组和第3组枝条接柑桔木虱的时间分别为矿物油农药处理后1 h、4 d和7 d,阳性对照组和阴性对照组接柑桔木虱时间为喷洒去离子水后1 h、4 d和7 d,同株一组的接虫时间相同。阴性对照是保证试验中的柑桔木虱成虫是不带黄龙病病菌,不参与抑制率统计分析,若阴性对照检测为阳性则试验无效。

根据“1.3.1”试验结果,待柑桔木虱在枝条上取食7 d后(整个取食过程在培养箱中,条件同上),每个枝条取柑桔木虱10头,单头提取DNA并检测,确定柑桔木虱对黄龙病病菌的获菌率,计算矿物油农药对柑桔木虱获取黄龙病病菌的抑制率。抑制率(%)=[(阳性对照组获菌率-处理组获菌率)/阳性对照组获菌率]×100。

1.4 数据分析

采用SPSS V21.0分析软件进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 矿物油农药对柑桔木虱选择行为的影响

处理组为嫩梢上喷洒矿物油农药(0.5%,体积分数,下同),对照组为嫩梢上喷洒去离子水,1 h后测定柑桔木虱成虫的趋性行为反应,选择喷洒去离子水嫩梢的柑桔木虱占比为15.4±0.62,选择矿物油农药处理过嫩梢的柑桔木虱占比为4.6±0.59,经t检验,两者差异极显著(p<0.01)。表明,矿物油农药对柑桔木虱有很强的驱避性。

驱避作用持效时间试验结果表明,喷洒矿物油农药1 h和1 d后驱避作用强,驱避率差异(变化)无显著性;矿物油农药处理后时间延长至4 d后,驱避率显著下降,驱避作用减弱;矿物油农药处理7 d后驱避率达38.54%,仍然有驱避作用(见图2)。

注:误差线所示为标准误,图中不同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在0.05水平差异显著。图3和图4同。

2.2 饲菌时长对柑桔木虱获菌率的影响

试验结果表明,在室内条件下,柑桔木虱成虫在取食1 d后即可获菌,获菌率为30.0%,取食1～5 d的获菌率没有明显差异,取食7 d的获菌率陡升至80.0%,此后获菌率出现波动,取食25 d的获菌率最高,达90.0%(见图3)。

图3 不同饲菌时长对柑桔木虱获菌率的影响

2.3 矿物油农药对柑桔木虱获取黄龙病病菌的影响

结果表明,矿物油农药对柑桔木虱获取黄龙病病菌具有明显的抑制作用,并且这种抑制作用随处理后时间的推移而显著减弱(见图4)。

图4 矿物油农药对柑桔木虱获取黄龙病病菌的抑制作用

3 讨论

使用Y型嗅觉仪测定了矿物油农药对柑桔木虱的驱避作用,发现矿物油农药对柑桔木虱的驱避作用明显,与Ouyang等[24]的研究结果一致,但与岑伊静等[25]的结果不同。岑伊静等[25]采用四臂嗅觉仪,只选择1个臂作为矿物油农药气味源,其余3个臂均为空白对照,这可能让柑桔木虱无法选择,因此表现出矿物油农药对柑桔木虱没有驱避作用,另外也有可能是不同类型的矿物油农药对柑桔木虱的驱避作用不一致。有研究表明,矿物油农药可减少棉花产生挥发性物质,达到干扰棉铃虫产卵的作用[32]。因此,矿物油农药也可能通过抑制或掩盖九里香挥发物,从而对柑桔木虱表现出驱避作用。有研究报道矿物油农药对柑桔木虱驱避作用的持效性大概为10 d[24],本研究结果与此相近,可见,矿物油农药对柑桔木虱的驱避作用较短暂。其原因可能是矿物油农药在光照条件下慢慢被降解所致[33]。

本研究表明柑桔木虱取食带黄龙病病菌的植株1 d后便可获菌,与黄金萍等[34]和傅致君[35]的研究结果一致;但是不同研究的获菌率差异较大,本研究为30.0%,其他研究分别为66.67%[34]和5.82%[35]。不同研究的获菌率差异,可能与病株带菌水平不同有关,同时,病菌在病株的空间分布不均匀[36],也有可能与取食部位有关,还可能与试验环境条件有关。

不同取食时间的试验表明,柑桔木虱取食7 d时获菌率接近峰值。因此,选择柑桔木虱取食7 d来研究矿物油农药处理对柑桔木虱获取黄龙病病菌的影响,结果表明,矿物油农药对柑桔木虱获取黄龙病病菌具有明显的抑制作用,抑制作用随处理后时间的推移而显著减弱,处理后1 h的抑制率高达86.67%,4 d降为54.83%,7 d降为7.60%。结合文献及本研究结果,推测矿物油农药能有效抑制柑桔木虱获取黄龙病病菌的主要原因是矿物油农药对柑桔木虱有驱避作用和拒食作用[37],导致柑桔木虱栖息较少,不取食或较少取食,从而抑制柑桔木虱获得黄龙病病菌。矿物油农药处理后时间越长抑制效果越差,矿物油农药驱避作用随时间减弱,试验中矿物油农药处理后4 d和7 d之间驱避率和抑制率均差异显著,但抑制率差距明显大于驱避率差距。这表明,矿物油农药抑制柑桔木虱获得黄龙病病菌的作用机制除与驱避作用有关,还可能存在其他原因。如:(1)矿物油农药对柑桔木虱获得黄龙病病菌有物理阻挡作用。柑桔木虱刺探矿物油农药处理过的感染黄龙病的柑桔叶片,口针可能触碰到矿物油农药,在口针尖端形成油膜使柑桔木虱无法获得黄龙病病菌[26,28]。(2)矿物油农药对柑桔木虱获得黄龙病病菌有生理干扰作用。有研究表明,非持久性病毒需要依靠蚜虫口针内的辅助蛋白才能黏附在蚜虫口针上,矿物油农药可以与辅助蛋白结合,使辅助蛋白无法与病毒结合,进而抑制蚜虫获取病毒[27,38]。柑桔木虱口针内可能存在协助黄龙病病菌进入柑桔木虱体内的辅助蛋白,而矿物油农药能够干扰黄龙病病菌与辅助蛋白结合,导致黄龙病病菌无法进入柑桔木虱体内。这些推测还需要进一步的研究。

本研究表明,矿物油农药对柑桔木虱具有明显的驱避作用,并且这种作用影响柑桔木虱获取黄龙病病菌。与传统的化学农药相比,矿物油农药作为一种绿色农药,不会使害虫产生抗性,而且对人畜及环境安全,可为抑制黄龙病传播提供一种很好的方案。我们前期的研究还发现,矿物油农药可杀灭柑桔木虱,且可作为化学农药增效剂,如与吡虫啉一定比例的混合可提升对柑桔木虱的杀灭作用[39]。因此,矿物油农药对果园内柑桔木虱和黄龙病均具有很好的控制效果,推荐黄龙病疫区柑桔园每间隔7 d喷一次矿物油农药。同时,田间使用矿物油农药控制柑桔木虱和黄龙病的实际效果尚待进一步的研究进行验证。