脊痛消胶囊对神经根型颈椎病作用机制的网络药理学研究

谢希，高曦，邓汉清，陈秋扬，石晔，娄宏君，王文韬

（1.黑龙江中医药大学第一临床医学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.湖南中医药大学第一临床医学院，湖南 长沙 410208；4.中南大学计算机学院，湖南 长沙 410083；5.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208）

颈椎病是一种椎间盘及相邻结构的退行性病变，根据其病理改变累积的结构不同，可分为神经根型颈椎病、脊髓型颈椎病、交感神经型颈椎病、椎动脉型颈椎病以及其他型颈椎病[1]，其中神经根型颈椎病（CSR）是最常见的类型[2]。CSR 的临床表现主要为颈部和单侧或双侧手臂的持续性、弥漫性及放射性疼痛，常常伴随着感觉异常和运动功能障碍[3]。

脊痛消胶囊是黑龙江中医药大学邓树福教授根据多年临床经验，并结合中医理论确立的处方，临床常用于CSR 及腰椎间盘突出等疾病的治疗，疗效确切[4-6]。但目前对于脊痛消胶囊治疗CSR 的有效活性成分及其作用机制研究较少。因此，本研究运用网络药理学技术对脊痛消胶囊治疗CSR 的活性成分及潜在靶点进行预测，研究其发挥效应的可能途经，再利用分子对接技术对网络药理学预测结果进行验证，为研究脊痛消胶囊治疗CSR 的作用机制提供新思路，为其临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 脊痛消胶囊活性成分收集与筛选

脊痛消胶囊是黑龙江中医药大学附属第一医院院内制剂，由川芎、泽泻、泽兰、车前子、白芍、防己、当归、杜仲、黄芪、延胡索、五灵脂、地龙、莪术和三棱共14 味药物组成。利用TCMSP 数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、TCM-ID数据库（bidd.group/TCMID）和BATMAN-TCM数据库（bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm/index.php）收集脊痛消组方的活性成分，然后设置口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%和类药性（Drug-likeness,DL）≥0.18 为筛选条件对收集到的活性成分进行筛选，得到脊痛消胶囊的有效活性成分。

1.2 脊痛消胶囊活性成分靶点检索和校正

利用TCMSP数据库对筛选出的脊痛消胶囊活性成分进行检索，得到相关蛋白靶点，利用Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org） 对蛋白靶点名称进行校正，以“Homo sapiens”为种属来源，选择已被验证的（reviewed）蛋白，删除未经验证（unreviewed）和无对应基因名的蛋白，得到蛋白靶点的基因名称。

1.3 CSR基因靶点筛选

利用GeneCards 数据库（https://www.genecards.org）、OMIM 数据库（https://www.omim.org） 和DisGe-NET 数据库（https://www.disgenet.org） 检索CSR 相关基因。CSR 属于周围神经损伤的范畴，为了尽量得到全面准确的检索结果，故将关键词peripheral nerve injury（周围神经损伤）、cervical radiculopathy（神经根型颈椎病）分别进行检索，获取与CSR 相关基因[7]。

1.4 脊痛消胶囊“药物—成分—靶点”网络构建与有效活性成分筛选

将脊痛消胶囊活性成分靶点与CRS 基因靶点导入Venny2.1.0 网站[Venny 2.1.0 (csic.es)]进行映射分析，将交集靶点基因与其对应的活性成分导入Cytoscape 3.9.1 软件构建脊痛消胶囊“药物 成分 靶点”网络，利用CytoNAC 插件进行拓扑分析，筛选出有效活性成分并保存分析结果。

1.5 蛋白相互作用网络构建与关键靶点筛选

将脊痛消和CSR 交集靶点基因导入String 数据库（https://string-db.org） ，设置置信度≥0.7，隐藏网络中孤立的节点，将结果保存为TSV 格式文件并在Cytoscape 3.9.1 软件中，对蛋白相互作用结果进行分析，构建可视化网络，利用Cytoscape 3.9.1 软件中的插件CytoNCA 进行关键靶点筛选。

1.6 GO功能分析和KEGG通路富集分析

将潜在治疗靶点导入R Studio 软件，利用ClusterProfiler 包对潜在靶点进行GO 功能和KEGG 通路富集分析，设置P ＜0.05，物种为Homo sapiens，再通过ggplot2 包对分析结果进行可视化。

1.7 分子对接及可视化

从Protein Data Bank（PDB）数据库（https://www.rcsb.org）下载各靶点基因的蛋白质晶体结构，从TCMSP数据库下载药物有效活性成分的3D 结构，利用Discover Studio 软件对受体蛋白进行去水和去配体等操作，运用AutoDockTools 软件对受体蛋白和配体小分子进行加氢和平衡电荷等修饰。利用AutoDock Vina软件对受体蛋白与配体小分子进行分子对接，结合能打分，之后利用PyMOL 软件将对接结果可视化。

2 结果

2.1 脊痛消胶囊活性成分收集与筛选

利用TCMSP 数据库、TCM-ID 数据库和BATMAN-TCM 数据库收集脊痛消的活性成分，结果当归2 种、地龙2 种、杜仲28 种、黄芪20 种、莪术3 种、三棱5 种、延胡索49 种、白芍13 种、防己3 种、车前子9 种、泽兰2 种、泽泻10 种、五灵脂6 种和川芎7 种。所有化合物去重后得到133 种活性成分。

2.2 脊痛消胶囊活性成分靶点预测

利用TCMSP 数据库查询脊痛消胶囊所含的133种活性成分，结果得到1 182 个靶点，其中当归50 个、地龙60 个、杜仲211 个、防己36 个、黄芪川芎27 个、208 个、三棱76 个、莪术22 个、延胡索208 个、白芍80 个、泽兰45 个、泽泻5 个和车前子154 个。去重后共得到275 个唯一靶点。

2.3 CSR靶点筛选

在数据库中以peripheral nerve injury（周围神经损伤）和cervical radiculopathy（神经根型颈椎病）进行检索后，分别获得7 783 和102 个基因靶点，删除重复值后共获得7 111 个与CSR 有关的基因靶点。

2.4 脊痛消活性成分-作用靶点网络构建与有效活性成分筛选

将上述获得的脊痛消作用靶点与CSR 靶点取交集后，得到潜在作用靶点，共245 个（图1）。使用Cytoscape 3.9.1 软件构建网络（图2）。网络由368 个节点和2 586 条边组成，其中红色V 形节点代表药物，绿色方形节点代表基因靶点，黄色圆形节点代表药物化学成分，蓝色六边形节点代表有效活性成分，每条边表示药物 活性成分、活性成分 潜在靶点之间的关系。根据度值（degree）大小筛选出排名前六的有效活性成分，见表1。

表1 有效活性成分信息Table 1 Active ingredient information

图1 脊痛消靶点和CSR 靶点交集Fig.1 Intersection of Jitongxiao capsule target and CSR target

图2 药物-活性成分-潜在靶点网络Fig.2 Drug active ingredient potential target network

2.5 蛋白 蛋白相互作用网络构建与分析

将245 个潜在靶点导入STRING数据库，设置置信度＞0.7，构建蛋白 蛋白相互作用网络，并利用Cytoscape 软件进行分析（图3），PPI 网络去除孤立节点后，共涉及228 个节点和3 308 条边。根据度值大小决定各节点大小、颜色深度和字体大小，节点越大、颜色越深，说明该节点是脊痛消作用于神经根型颈椎病的关键靶点，筛选出11 个核心靶点，见表2。

表2 核心靶点信息Table 2 Core target information

图3 蛋白互作可视化结果Fig.3 Visualization results of protein interaction

2.6 GO功能分析

借助R 语言进行分子功能（MF）、生物过程（BP）和细胞组成（CC）分析，绘制结果排名前十的柱状图和气泡图（图4）。生物学过程主要表现为对异种刺激的反应、对氧气水平降低的反应、细胞对化学刺激的反应和对脂多糖的反应等；细胞组分主要包括突触后膜、膜微结构域、突触前膜组成部分和细胞膜上的膜筏等；分子功能主要包括神经递质受体活性、G 蛋白偶联受体活性、突触后神经递质受体活性、核受体活性、配体激活的转录因子活性、DNA结合转录因子的活性和儿茶酚氨结合等。

图4 GO 功能分析Fig.4 GO function analysis

2.7 KEGG通路富集分析

KEGG 分析结果显示，潜在靶点主要涉及脂质、动脉粥样硬化（Lipidandatherosclerosis）、晚期糖基化终末产物 糖基化终末产物受体信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、前列腺癌（Prostate cancer）、白介素-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、乙型肝炎（Hepatitis B）、人类巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、丝裂原活化蛋白激酶信号通路（MAPK signaling pathway）、非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）和人类T 细胞白血病病毒 型感染（Human T-cell leukemia virus 1 infection）等，见图5。

图5 KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

2.8 分子对接验证结果

蛋白互作结果显示：AKT1（PDB ID:1UNQ）、TP53（PDB ID:1AIE）、JUN（PDB ID:1S9K）、TNF（PDB ID:2AZ5）、HSP90AA1（PDB ID:3Q6N）、EGFR（PDB ID:2GS7）、IL6（PDB ID:4CNI）、CTNNB1（PDB ID:1G3J）、CASP3（PDB ID:1NMS）、RELA（PDB ID:3QSY）、MAPK1（PDB ID:4IZ5）在脊痛消胶囊治疗CSR 的过程中发挥着重要作用。利用Autodock 软件将脊痛消的关键活性成分与潜在靶点进行分子对接，结合能≤20.93 kJ/mol表明活性成分与靶点有较强的结合活性，分子对接结合能结果，见图6。用PyMOL 软件将对接的结果进行可视化（图7），活性成分与作用靶点之间主要是通过氢键等分子作用力形成较强结合力，槲皮素与TYR-285、HIS-252 两个氨基酸以氢键结合到RELA（图7 A）；山柰酚与HIS-252以氢键结合到RELA（图7 B）；山柰酚与ALA-422、CYS-569 和LYS-520三个氨基酸以氢键结合到JUN（图7 C）；谷甾醇与ASP-831 和LYS-721 以氢键结合到EGFR（图7 D）；山柰酚与SER-65、GLY-44、TRP-47、TYR-96和PHE-98五个氨基酸以氢键结合到IL-6（图7 E）；槲皮素与ASP-831、YHR-830、LYS-721 和MET-769 4 个氨基酸以氢键结合到EGFR（图7 F）；谷甾醇与ASP-1、GLU-64以氢键结合到IL-6（图7 G）；谷甾醇与MET-108 以氢键结合到MAPK1（图7 H）；山柰酚与GLU-29、HIS-61以氢键结合到MAPK1（图7 I）；谷甾醇与TRP-80、LEU-78以氢键结合到AKT1（图7J）；山柰酚与MET-769、THR-830 和LYS-721 以氢键结合到EGFR（图7 K）；谷甾醇与LEU-260 以氢键结合到RELA（图7 L）。

图6 分子对接结合能热图Fig.6 Thermograph of molecular docking binding energy

图7 分子对接示意图Fig.7 Molecular docking diagram

3 讨论

CSR 属于中医“痹症”和“项强”的范围，外伤或劳损等原因，导致局部气血运行紊乱，正气虚弱，瘀血内停，水湿内阻，血水互结，经脉不通，日久失养从而致病，总的病机是气机不畅、经脉闭阻。根据不同临床表现可将其分为风寒阻络证、寒湿阻络证、气滞血瘀证、气血亏虚证和肝肾亏虚证，可分别予以祛风散寒、散寒除湿、活血化瘀、补益气血和滋补肝肾之法[8]。脊痛消胶囊是黑龙江中医药大学附属第一医院院内制剂，由当归、川芎、泽兰、泽泻、车前子、白芍、防己、杜仲、黄芪、延胡索、三棱、地龙、莪术和五灵脂共14 味药物组成，其中当归和白芍补血；车前子、泽泻和防己利水消肿除湿；川芎和延胡索行气止痛；黄芪补气升阳，以助血行；五灵脂活血化瘀、缓急止痛，共奏活血化瘀、祛风通络之功效[9]。临床此方用于治疗CSR 疗效显著，但尚未明确是哪些活性成分通过何种作用机制发挥相应效应的。

本研究利用网络药理学的方法从脊痛消胶囊14味药物中筛选出了133 种活性成分，275 个靶点基因，其中245 个靶点基因与CSR 相关，构建药物 活性成分 靶点网络图，显示有385 个节点和2 648 条边，显示了脊痛消胶囊多成分、多靶点作用于CSR 的特点。GO 分析结果显示，-谷甾醇、山柰酚、槲皮素、豆甾醇和常春藤皂苷元等化学成分与对异种刺激的反应、对氧气水平降低的反应、细胞对化学刺激的反应和对脂多糖的反应等作用机制相关。分子对接结果显示，-谷甾醇、山柰酚、槲皮素、豆甾醇和常春藤皂苷元与AKT1、JUN、TNF、HSP90AA1、P53 和IL-6 等关键靶点有较强的结合力，KEGG 分析结果显示，脊痛消的有效成分可以调控AGE-RAGE 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、白介素 17 信号通路和丝裂原蛋白活化激酶信号通路等，说明脊痛消胶囊包含的多种活性成分是通过多靶点和多通路实现对CSR 的治疗作用的。

AKT 也称为蛋白激酶B，是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，AKT1 是最重要的亚型之一，在多种生物学过程中发挥重要作用[10]。研究显示，AKT1 是治疗神经根型颈椎病的关键靶点之一，激活AKT 信号通路可抑制神经细胞自噬和凋亡，修复受损神经根，显著抑制椎间盘软骨细胞的凋亡[11,12]。-谷甾醇和山柰酚可通过激活AKT 通路抑制细胞凋亡[13,14]，槲皮素可减轻神经缩窄引起的神经病理性疼痛[15]，抑制由脊髓损伤引起的神经元自噬[16]。肿瘤坏死因子（TNF），是一种炎症介质，可以增加破骨细胞的分化从而加重关节损伤和骨质丢失[17]，颈椎间盘退化患者血清中TNF和IL-6水平显著上升[18]，本团队前期研究发现，脊痛消胶囊可显著降低神经根型颈椎病模型大鼠神经根IL-6 的水平[19]。槲皮素可降低TNF- 水平从而减轻脊髓炎症反应[20]，山柰酚可以靶向调节TLR4/NF- B信号通路，降低TNF 水平发挥保护神经元的作用。JUN 蛋白是激活蛋白-1（AP-1）复合体中研究最广泛的蛋白，参与增殖、凋亡、存活和肿瘤发生等多种细胞活动[21]。据报道，JUN 蛋白在周围神经系统损伤后修复中发挥重要作用，其表达上调可促进神经修复，然而随着失神经时间延长，JUN的表达逐渐降低[22]，研究表明[23]，槲皮素可下调JUN 蛋白磷酸化水平发挥保护雪旺细胞（SCs）的成髓鞘功能。热休克蛋白90（HSP90）是一种重要的分子伴侣，用以保证其他蛋白质在生物学过程中保持结构和功能的稳定[24]。在周围神经损伤模型中，HSP90通过与双亮氨酸链激酶结合促进轴突损伤信号的传递，增加神经元的修复与再生[25]。研究表明，HSP90 在抑制神经病理性疼痛的过程中与TLR4 发挥着协同作用[26]。

脊痛消胶囊治疗神经根型颈椎病的生物学过程主要涉及对（细胞）外刺激的反应、对缺氧的反应、细胞对化学刺激的反应、对活性氧的反应和对脂多糖的反应等。炎症反应是神经根型颈椎病的重要病理过程，临床研究表明，神经根型颈椎病患者血清中TNF、IL-1 和IL-6 水平显著升高，IL-2 水平显著降低，炎症反应是导致神经根性痛的主要原因[27,28]。活性氧（ROS）是一种分子质量小但活性高的物质，主要包括氧阴离子、氧自由基（超氧化物和羟基自由基）和过氧化氢等过氧化物，可以氧化包括蛋白质、DNA 和脂质在内的多种细胞组分[29]。最新研究显示，ROS靶向介导NOX2/PI3K/AKT 信号通路的激活促进损伤后神经轴突的再生和功能恢复[30]。KEGG 富集分析发现，脊痛消胶囊治疗神经根型颈椎病的靶向信号通路主要有AGE-RAGE 信号通路、TNF 信号通路、IL-17 信号通路和MAPK 信号通路等。AGEs 是葡萄糖或者果糖等其他糖类对蛋白质、核酸等大分子进行翻译后非酶修饰得到的异质分子，在各年龄相关性疾病中，AGEs 与受体RAGEs结合，可促进氧化应激从而加强炎症反应[31]。MAPK/ERK 信号通路在周围神经损伤修复过程中发挥着重要作用，研究显示，周围神经损伤后，神经元和轴突中的MAPK/ERK1 通路激活，且ERK 磷酸化水平随时间变化而不同[32]。免疫反应是神经根型颈椎病根性痛发生的原因之一[33]，白介素17（IL-17）是由辅助性T细胞17 分泌的一种促炎因子，介导炎症反应和自身免疫性疾病的发生，周围神经损伤后，TH17 数量显著增加，释放IL-17 促进机械性疼痛超敏反应的发生[34]。

综上，本研究基于网络药理学和分子对接技术预测脊痛消胶囊治疗神经根型颈椎病的分子机制，结果表明，脊痛消胶囊中包括-谷甾醇、槲皮素、山柰酚和豆甾醇在内的多种活性成分可以稳定结合AKT1、TNF、JUN和MAPK等作用靶点，通过TNF信号通路、MAPK信号通路、IL-17 信号通路和AGE-RAGE 信号通路调控氧化应激和炎症反应等生物学过程发挥治疗神经根型颈椎病的作用。但本研究也存在一定的局限性，只研究了分子对接对网络药理学结果的验证，应进一步研究体内、外试验，使试验结果更具有科学性和准确性，为脊痛消胶囊的临床应用提供理论参考依据。