单核细胞增生李斯特菌LAMP检测方法的建立及应用

陈平亚 何翠华 张亮亮 吴少荣 王绥家 赵光远

摘要 ［目的］建立一种单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）检测方法，并对其检测敏感性、特异性进行评价。［方法］针对单增李斯特菌的actA基因序列，设计6条LAMP特异性引物，通过对LAMP反应体系中的反应温度、内外引物浓度比、镁离子浓度等各参数进行优化，确定最优反应体系。以单增李斯特菌株CMCC54006株为阳性对照，其他菌株为阴性对照，验证LAMP检测方法的特异性。将纯培养的单增李斯特菌菌液提取DNA后10倍梯度稀释为模板进行LAMP检测，以测定该检测方法灵敏度。［结果］建立了特异性检测单增李斯特菌的LAMP检测方法，优化后确定了检测体系中FIP/BIP与F3/B3 的终浓度比为1.6∶0.2，镁离子浓度为6 mmol/L，dNTPs浓度为1.6 mmol/L，反应温度为65 ℃。特异性检测结果显示，仅单增李斯特菌反应管中的反应液呈绿色，表明建立的检测方法具有较高特异性。以单增李斯特菌DNA为模板进行的LAMP检测结果显示，LAMP检测方法灵敏度为64 copies/mL。［结论］建立单增李斯特菌的LAMP检测方法，高效特异，灵敏度高，可直接观察检测结果，适合现场检测。

关键词 单增李斯特菌；環介导等温扩增；actA基因

中图分类号 TS207.4  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）10-0074-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.10.016

Abstract ［Objective］ The objective of this study is to establish a rapid and specific method to detect  Listeria monocytogenes using loopmediated  isothermal amplification.［Method］ Six specific LAMP primers were designed to target the actA gene of L.monocytogenes.Singlefactor experiments were conducted to optimize the parameters of the reaction system .The specificity of LAMP was tested by using  non L.monocytogenes.The sensitivities of  LAMP were compared by using tenfold serially diluted DNA as templates.Furthermore，the samples  which may be infected by L.monocytogenes were detected by LAMP method.［Result］The LAMP assay for rapidly and specifically detecting L.monocytogenes was established.The reacting temperature was determined as 65 ℃ ，the concentration of Mg2+ was 6 mmol/L  and  the concentration of dNTPs was 1.6 mmol/L.The concentration ratio of inner and outer primers was 1.6∶0.2.The result of specificity test showed that only the reaction liquids with the DNA of  L.monocytogenes  change green.Sensitivity experiments indicated that the detection limit could reach 64 copies/mL.［Conclusion］ The LAMP assay had advantages of sensitivity and specificity，the reaction results could be directly observed by naked eyes and  suitable to be widely used in grassroots units.

Key words Listeria monocytogenes;LAMP;actA gene

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，单增李斯特菌）是一种常见的兼性厌氧的革兰阳性食源性致病菌，能在土壤、地表水及冰箱中生存，能通过粪口传播［1］。单增李斯特菌能够穿越动物血脑屏障、血胎屏障［2］，引起败血症、脑膜炎等，为避免食品安全事件，需要建立快速、灵敏、特异性的单增李斯特菌检测方法。

目前，单增李斯特菌的国标鉴定方法是平板分离培养，样品中单增李斯特菌的检测经过2次增菌、选择性培养基分离以及生化鉴定，全过程耗时长。目前分子生物学检测方法被广泛应用，如荧光定量PCR技术、重组酶聚合酶扩增技术、CRISPR 技术等［3］。LAMP技术是在Bst酶的作用下，在恒温条件下反应45 min即可完成核酸扩增，扩增结果可通过染料颜色、浊度等判断反应结果，耗时少且对试验仪器的要求低［4］。该研究以单增李斯特菌的保守基因actA作为靶基因来建立LAMP的检测方法，用于单增李斯特菌的现场快速检测。

LAMP可以在恒温条件下特异、快速地扩增核酸，不需要昂贵的温控设备、检测成本低且结果可视，已被广泛应用于细菌、病毒等病原体的快速检测［5］。针对特异性目标基因中6个区域设计6条引物，利用Bst DNA聚合酶扩增。在DNA合成过程中，从脱氧核糖核酸三磷酸（dNTPs）底物中析出的焦磷酸离子与体系中的镁离子反应，产生白色焦磷酸镁沉淀，其难溶于水，且可通过肉眼直接观察［6］，因此可以把浑浊度作为反应的指标，也可向PCR管中添加染料辅助观察扩增结果，该试验通过加入0.2 μL SYBR Green I （10×）染料，加入反应管盖中37 ℃烘干4 h，待 LAMP 反应结束后，显色染料与反应液混匀，根据显色结果对样本的阴阳性进行判断。

对单增李斯特菌CMCC54006菌株actA基因序列（DQ309883.2）进行测序，将actA基因与其他菌株的同源序列进行比对分析后，利用Primer ExplorerV5 软件在线设计LAMP引物。笔者以actA毒力基因为单增李斯特菌靶基因建立荧光LAMP检测方法，建立快速精准检测单增李斯特菌的技术，有助于及时检测单增李斯特菌，以确保食品安全。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试标准菌株包括单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）、大肠埃希氏菌（Escherichia colt）、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）、河流弧菌（Vibrio fluvialis）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus），购自中国医学细菌菌种保藏管理中心。

试验主要试剂：培养基购自北京陆桥公司; MgSO4、SYBR Green I 染料购自Sigma公司; dNTP、Bst DNA聚合酶购自上海研拓生物科技有限公司; DNA marker、细菌基因组DNA提取试剂盒，购自上海生工生物技术有限公司; 6 × DNA LoadingBuffer购自天根生物技术公司; 琼脂糖购自西班牙Biowest公司。

试验主要仪器：DYY-10C型电泳仪，购自北京市六一仪器厂;凝胶成像，仪购自美国UVP公司。

1.2 试验方法

1.2.1 LAMP特异性引物、探针设计。LAMP特异性引物的设计根据单增李斯特菌的actA基因，利用LAMP在线引物设计软件 Primer Explorer V5设计特异性引物。F3：CGAAAGCGCCTCAGTTTA；B3：CGTGGGTGTACATGTAATCG；FIP：GTCTCGAACAAGGCGTGAGTTTCATCAAGGCACAAGCG；BIP：CCGAAGAGCACGGTTTCGTCGATGAGCGGTTGATGTC；LoopF：CGTGATGTTGTAACCTTGCG；LoopB：GCGAGCGATCCTTGTTTG。

1.2.2 LAMP反应体系的优化。

25 μL反应体系包括： 外引物F3和B3，内引物 FIP和BIP，MgCl2，缓冲溶液（ Buffer）， dNTPs，DNA模板，BstDNA聚合酶。在65 ℃恒温水浴锅中恒温1 h，然后80 ℃灭活5 min终止反应。优化LAMP反应体系各参数，包括内外引物浓度（μmol/L）比（0.8∶0.2、1.0∶0.2、1.2∶0.2、1.4∶0.2、1.6∶0.2、1.8∶0.2、2.0∶0.2）、镁离子终浓度（1、2、3、4、5、6、7、8 mmol/L ）、dNTP浓度（0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mmol/L）、BstDNA聚合酶浓度（0.16、0.20、0.24、0.28、0.32 U/μL）以及反应所需的最适温度，择优建立LAMP反应体系。

1.2.3 LAMP反应的特异性。以单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、威氏李斯特菌（Listeria welshimeri）、蠟样芽孢杆菌（Bacillus cereus）等病原体作为对照菌株，并用去离子水作为空白对照，验证LAMP法检测单增李斯特菌的特异性。

1.2.4 LAMP反应的灵敏度试验。

采用稀释平板法计算得到初始菌液浓度为6.4×106 CFU/mL的菌悬液，再用0.9%生理盐水进行10倍梯度稀释，制备浓度为6.4～6.4×106 CFU/mL的菌液，分别提取单增李斯特菌DNA，按上述LAMP体系进行检测。以各稀释浓度的DNA为模板，以ddH2O为空白对照，进行LAMP反应。以确定灵敏度。取5 μL LAMP反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，观察试验结果。

1.3 模拟样品LAMP检测方法的应用

以市场购买的新鲜猪肉作为原始模拟样本，称取25 g采用国标GB 4789.30—2016方法进行单增李斯特菌的分离培养鉴定，单增李斯特菌检测阴性的猪肉样本被认为无单增李斯特菌污染，可用于制备模拟样本。挑取参考株CMCC54006单菌落接种到5 mL BHI液体培养基，37 ℃ 220 r/min增菌直至OD600达到0.6，吸取100 μＬ增菌液到900 μL PBS缓冲液中进行连续10倍稀释，得到6.4×104 CFU/mL的菌液。

在市场中采集362份速冻肉类及肉加工制品，取25 g样品加入225  mL无菌生理盐水均质，制成肉糜类样品均质液，将浓度为6.4×108 CFU/mL菌悬液进行10倍梯度稀释，制备浓度为6.4×104 CFU/mL的菌液，取不同浓度的初始菌液1 mL分别加入9  mL速冻肉糜类样品均质液中，37  ℃培养10 h后，取1  mL菌液提取细菌基因组 DNA，分别采用该研究建立的LAMP反应方法和国标GB 4789.30—2016方法进行检测，用PALCAM平板和单增李斯特菌显色平板划线培养，再进行生化试验鉴定。比较2种方法的检测结果，并计算总体符合率。

2 结果与分析

2.1 LAMP检测方法反应条件的优化

2.1.1 反应温度优化。LAMP反应设置61～66 ℃ 6个连续反应温度，从图1可见，6个反应温度下均有扩增条带，根据琼脂糖凝胶电泳结果中条带的清晰度及整齐度，确定最佳反应温度为65 ℃。

2.1.2 镁离子浓度优化。当镁离子浓度在1～8 mmol/L时，Mg2+含量过低或过高都会影响LAMP反应，Mg2+浓度为6 mmol/L 时，LAMP反应琼脂糖凝胶电泳结果中条带最亮，确定该镁离子浓度为反应体系的最佳浓度（图2）。

2.1.3 内外引物浓度比优化。LAMP反应中，不同的内外引物浓度比为1.8∶0.2、2.0∶0.2时，条带较暗；当内外浓度比为0.8∶0.2、1.0∶ 0.2、1.2∶0.2、1.4∶0.2时，对 LAMP反应结果的影响不显著，内外引物比为1.6∶0.2时条带最亮。因此，选择其作为该扩增体系的内外引物浓度比（图3）。

2.1.4 dNTPs浓度优化。不同的dNTPs添加量对扩增反应影响明显，dNTPs浓度为0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L时，LAMP反应条带较暗，dNTPs浓度为1.6、1.8、2.0、2.2 mmol/L时，条带较亮且无显著差异，因此选择LAMP反应的dNTPs浓度为1.6 mmol/L（图4）。

2.1.5 Bst DNA聚合酶浓度优化。不同的Bst DNA聚合酶添加量对扩增反应影响明显，酶浓度为0.32 U/μL时，LAMP反应条带较亮，因此选择LAMP反应的Bst DNA聚合酶浓度为0.32 U/μL（图5）。

2.2 LAMP检测方法特异性分析

分别以单增李斯特菌及其他菌株的DNA为模板，按照建立的LAMP方法进行扩增反应，观察各反应管中颜色，其中单增李斯特菌DNA有条带，对应的反应管中呈绿色，其他菌株及空白对照无条带且反应液为橙黄色，表明该试验设计的引物具有较强的特异性（图6）。

2.3 LAMP检测方法灵敏度分析

将浓度为6.4～6.4×106 copies/μL单增李斯特菌菌液基因组DNA，同时按PCR方法和建立的 LAMP方法进行扩增。结果显示，LAMP法检测单增李斯特菌的下限为64 copies/μL（图7），该研究建立的LAMP方法敏感性较高。

2.4 LAMP检测方法的应用

对362份速冻肉类及加工制品模拟样本进行LAMP方法和国标方法GB 4789.30—2016检测。LAMP方法检测结果显示，除了单增李斯特菌基因组DNA阳性对照外，33份样品检测到单增李斯特菌，结果见表1。与国标法检测结果符合率为 100%，显示该 LAMP 方法具有良好的可靠性。

3 讨论

该研究基于actA基因序列设计了检测单增李斯特菌的LAMP检测方法扩增引物，以其为靶序列设计LAMP扩增引物，并验证其灵敏性和特异性。若扩增结果通过电泳进行判断，会因气溶胶污染而出现假阳性，且电泳判断结果费时费力。该试验中反应前于PCR管内加入染料，反应结束后无需开盖即可观察结果，避免污染，不需要PCR仪等昂贵仪器，仅用水浴锅即可检测，成本低，效率高，适合基层实验室应用，具有较强的应用前景。

该研究建立的可视化LAMP方法灵敏度可以达到64 copies/μL。贺生芳等［7］针对单增李斯特菌iap基因设计LAMP引物和探针，建立了最低检测限为2.21 CFU/mL 的检测体系。贾甜甜［8］针对单增李斯特菌hly基因建立最低检测限为94.70 CFU/mL的LAMP检测体系。姜霞等［9］针对编码溶血素的hly基因设计引物和探针，对单增李斯特菌纯菌液的检测灵敏度为88.00 CFU/mL，人工污染肉中单增李斯特菌的检测灵敏度为880.00 CFU/mL。顾思宇等［10］针对Lm编码内化素蛋白基因建立了检测下限为38 CFU/mL的LAMP检测方法，但该方法未做到可视化检测。在不同的LAMP反应体系中，灵敏度有少許差异，原因可能是在不同引物长度、引物溶解温度、引物间距离、GC含量、引物末端稳定性与二级结构导致引物和模板的结合率受到了不同程度的影响，也可能与反应中酶活性、化学试剂及操作有关［11］。

利用该可视化LAMP方法对单增李斯特菌和其他食源性致病菌进行检测，只有单增李斯特菌出现阳性反应，证实该可视化LAMP方法具有很好的特异性。当LAMP扩增进行时，白色焦磷酸镁沉淀与反应液中的双链DNA含量成正比，因此可通过浊度仪检测焦磷酸镁的沉淀量来判定是否发生扩增反应［12］。也可在反应体系中加入钙黄绿素，其能在Mg2+ 离子与焦磷酸根离子结合时发出荧光［5］。该试验通过在LAMP反应体系中添加SYBR Green I染料，建立可视化LAMP反应，减小开盖时造成的气溶胶扩散，避免检测结果假阳性。

4 结论

该研究根据单增李斯特菌 actA基因序列设计特异性引物，建立了可视化LAMP检测方法。该检测方法灵敏度高，最低检测限为64 copies/μL；特异性强，与金黄色葡萄球菌等其他食源性致病菌无交叉反应。LAMP检测时间短只需要45 min，现场操作步骤简单，只需一台金属浴，检测试剂成本较低。对样品的检测结果与国标方法检测结果一致，可在食品安全检测中应用于对单增李斯特菌的快速检测。

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