牦牛乳低聚糖与人乳低聚糖的比较研究

盛王涛 杨丽菲 谢小俐 胡瑞 李菁

摘 要：目的：检测分析牦牛乳特定低聚糖组分、含量及构成比，并与人乳比较，探讨其作为代乳品的优势与不足。方法：对中国西藏若尔盖地区分散采集的20头牦牛产崽1 w时的牦牛乳样本，及从20名分娩足月婴儿的妇女中获得的分娩后2 w（对照1组）和6 w（对照2组）的人乳样本，采用液质联用（LC-MS）方法进行乳汁低聚糖特定组分的定量分析。结果：牦牛乳组14种低聚糖总含量为（269.9±24.1）μg/mL，人乳组14种低聚糖总含量为（4 641.3±1 071.5）μg/mL，其中2 w时含量为 （5 156.1±916.4）μg/mL、6 w时含量为 （4 126.5±979.2）μg/mL，牦牛乳组与2个人乳组两两比较的组间差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。牦牛乳组与2个人乳组各低聚糖组分含量分别比较显示，乳-N-二岩藻六糖II型（LNDPF II）不存在组间差异（P＞0.05），其余差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。2个人乳组各低聚糖组分含量比较显示，2′-岩藻糖基化乳糖（2FL）、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-二岩藻六糖II型（LNDPF II）、3′-唾液酸乳糖（3′-SL）、6′-唾液酸乳糖（6′-SL）組间差异有统计学意义（P＜0.05），其他无显著性差异（P＞0.05）。牦牛乳组与2个人乳组各低聚糖构成比两两比较显示，均不存在组间差异（P＞0.05）。牦牛乳组中性/酸性低聚糖构成比与2个人乳组分别比较的组间差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。2个人乳组之间中性/酸性低聚糖构成比不存在组间差异（P＞0.05）。结论：人乳特有低聚糖的组成和丰富程度是其他动物乳不可替代的，牦牛乳低聚糖含量大于牛乳低聚糖含量，其个别中性及酸性低聚糖组分接近甚至超过人乳中同种组分，可能是一种有前途的人乳替代来源。

关键词：牦牛乳;低聚糖;人乳低聚糖;组分

人乳是婴幼儿营养的黄金标准，人乳低聚糖是其主要成分之一，构成人乳中碳水化合物的较大部分（20%，5～20 g/L）[1-2]。人乳低聚糖的多样性丰富，观察到247个品种，162种人乳低聚糖具有结构特征[3]，其组成和丰度因母亲的遗传和哺乳期而异，也受妊娠年龄、母亲健康状况、婴儿性别、饮食习惯、乳母Lewis血型[4]的影响。这些低聚糖起到益生元、免疫调节剂和病原体抑制剂的作用，并被发现能改善肠道和大脑功能。牛奶传统上是婴儿配方奶粉的基础，对牛乳低聚糖的研究少于对人乳低聚糖的研究，与人乳低聚糖相比，牛乳低聚糖的浓度要低得多（0.03～0.06 g/L）[5]。婴儿配方奶粉通常含有益生元，但缺乏人乳低聚糖的特殊功能。牦牛发源于中国，是一种能适应高原地区环境的优势畜种。现阶段，我国丰富的牦牛乳资源尚未被充分开发利用，国内主要的牦牛乳衍生品类型有奶粉、液态奶、酸奶、奶茶和干酪素等，生产和加工企业主要分布在西藏、青海、甘肃、四川等4个牦牛分布多的省份[6]。牦牛乳成分与普通牛乳成分不同，由于畜种及地区等因素限制了对牦牛乳的成分的研究，很少有研究报告牦牛乳低聚糖。本研究检测分析牦牛乳特定低聚糖的组分、含量及构成比，并与人乳比较，探讨其作为代乳品的优势与不足。

1 材料与方法

1.1 奶样和标本收集

1.1.1 牦牛乳 在中国西藏若尔盖地区分散采集的20头牦牛产崽1 w时的牦牛乳样本。样本在环境温度下10 min内收集，干冰运输到实验室，并在-80 ℃下储存。

1.1.2 人乳 从20名分娩足月婴儿的妇女中获得的分娩后2 w（对照1组）和6 w（对照2组）的人乳样本。采集样本后用干冰运送到实验室，并在-80 ℃下储存。

1.2 伦理审核

研究机构伦理审查委员会批准了该研究的所有方面（批件号：SCMCIRB-K2018096-1），并获得了所有母亲的知情同意。

1.3 方法

1.3.1 样本前处理 取乳样100 μL，4 000 g、4 ℃离心10 min后，去除上层脂肪，将50 μL下层清液装新离心管中，然后加入100 μL乙醇。接着12 000 g、4 ℃离心60 min，离心后，乳样分为两部分，低聚糖位于上清液中，底部沉淀为酪蛋白，获取上清液弃去沉淀。向50 μL上清液中加入950 μL纯水。接着取25 μL 稀释后的上清液，加入25 μL NaBH4水溶液（0.5 mol/L），在室温下孵育30 min。接着加入25 μL乙酸溶液（0.5 mol/L）终止反应。最后取10 μL用于LC-MS检测。

1.3.2 基于UPLC-QTOF-MS的低聚糖靶向代谢组学 （1）色谱方法：色谱柱为Hypercarb石墨碳色谱柱（100 mm×2.1 mm i.d.，3 μm;Thermo Fisher）流动相A为水、流动相B为纯乙腈、流速为0.2 mL/min、进样量为10 μL、柱温为25 ℃。（2）质谱条件：离子源类型为ESI，电喷雾离子源。（3）电离模式：负离子模式（ESI-）。（4）数据采集模式：TOFMS采集一级质谱信息，即分子离子峰的精确质荷比，IDAMS/MS模式采集二级质谱信息，即碎片离子的精确质荷比。一级质谱信息主要用于低聚糖化合物的定量分析、二级质谱信息主要用于低聚糖化合物的定性分析。

1.3.3 低聚糖标准品 14种低聚糖标准品包括2′-岩藻糖基化乳糖（2FL）、3′-岩藻糖基化乳糖（3FL）、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-新四糖（LNnT）、乳-N-岩藻五糖I型（LNFP I）、乳-N-岩藻五糖II型（LNFP II）、乳-N-岩藻五糖III型（LNFP III）、乳-N-岩藻五糖V型（LNFP V）、乳-N-二岩藻六糖I型（LNDPF I）、乳-N-二岩藻六糖II型（LNDPF II）、唾液酸乳-N-四糖a（LSTa）、唾液酸乳-N-四糖c（LSTc）、3′-唾液酸乳糖（3′-SL）、6′-唾液酸乳糖（6′-SL），均购自法国ElcitylOligoTech公司。其中，中性低聚糖10种（8种岩藻糖基化和2种未糖基化低聚糖）、酸性低聚糖4种（唾液酸化低聚糖）。

1.4 统计分析

所有数据采用SPSS软件进行统计学处理。正态分布的计量资料采用x±s描述，两组之间计量资料比较采用t检验，计数资料采用卡方检验，当P<0.05，认为组间差异的显著性具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 一般资料

本组共牦牛乳20份（20头牦牛产崽1 w时的牦牛乳样本）、人乳40份（从20名分娩足月婴儿的妇女中获得的40份人乳样本，其中，20份为产后2 w采集、20份为产后6 w采集）。

2.2 牦牛乳中14种低聚糖成分测定及其与人乳的比较

2.2.1 低聚糖总量 牦牛乳组14种低聚糖总含量为（269.9±24.1）μg/mL，人乳2组14种低聚糖总含量为（4 641.3±1 071.5）μg/mL［其中对照1组为（5 156.1±916.4）μg/mL、对照2组为（4 126.5±979.2）μg/mL］，牦牛乳组与2个人乳组两两比较的组间差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。

2.2.2 各低聚糖含量比較 牦牛乳组与2个人乳组14种低聚糖含量分别比较显示，乳-N-二岩藻六糖II型（LNDPF II）不存在组间差异（P＞0.05），其余差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。2个人乳组14种低聚糖含量比较显示，2-岩藻糖基化乳糖（2FL）、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-二岩藻六糖II型（LNDPF II）、3′-唾液酸乳糖（3′-SL）、6′-唾液酸乳糖（6′-SL）组间差异显著性存在统计学意义（P＜0.05），其他不存在组间差异（P＞0.05）（表1）。

2.2.3 各低聚糖构成比及中性/酸性低聚糖构成比比较牦牛乳组与2个人乳组14种低聚糖构成比两两比较显示，均不存在组间差异（表2）。牦牛乳组中性/酸性低聚糖构成比（42.3%/57.7%）与对照1组（80.8%/19.2%）比较的组间差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。牦牛乳组中性/低聚糖构成比（42.3%/57.7%）与对照2组（82.5%/17.5%）比较的组间差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。2个人乳组中性/酸性低聚糖构成比不存在组间差异（P＞0.05）。

3 讨论

低聚糖是一类含3～9个单糖单元的碳水化合物，人乳低聚糖含量丰富，是乳汁中第三大固体成分，已知种类高达200余种[7]，具有益生元、免疫调节剂和病原体抑制剂的作用，能改善乳儿肠道功能。牛乳低聚糖结构与人乳相似，已鉴定出67个组分，且含量远低于人乳中的低聚糖，研究报道仅为0.03～0.06 g/L [5]，以6′-SL含量最高，其余低聚糖含量均测不出或微量[8]。牛乳低聚糖构成比与人乳也有所不同，如唾液酸在牛初乳中含量高达70%，而在人初乳中仅为20%[9]。由此可见，牛乳中主要是酸性低聚糖，并随着泌乳期延长由32%（初乳）降低到6%（产乳30 d）[10]，而牦牛乳低聚糖的研究数据未见发表。本研究率先开展对牦牛乳中常见人乳低聚糖的检测分析，已测的14种低聚糖定量结果显示，牦牛乳低聚糖总含量低于人乳，但高于牛乳，约为后者的5～10倍，其中6′-SL含量与牛乳相当。此外，本研究结果说明，牦牛乳与人乳各低聚糖构成比无明显差异，提示牦牛乳低聚糖组成的相对安全性。其中，牦牛乳中性低聚糖占比低于人乳，酸性低聚糖占比高于人乳，与以往文献报道相符[9]。

人乳低聚糖充当益生元，刺激有益菌的生长。纯人乳喂养的婴儿肠道微生物群含高达90%的双歧杆菌，而配方奶喂养的婴儿肠道微生物群与成人相似[11]。低聚半乳糖（GOS）和低聚果糖（FOS）作为益生元经常被添加到婴幼儿配方奶粉中。2FL与肠粘膜上皮细胞的H-2表位的结合，防止空肠弯曲菌粘附到宿主上[12]。2FL通过降低CD14信使核糖核酸（mRNA）的转录来调节CD14的表达，从而抑制I型菌毛大肠杆菌感染引起的炎症[13]。3FL和LNFP II被证明能特异性阻断绿脓杆菌[14]。唾液酸乳糖（SL）能抑制大肠杆菌、铜绿假单胞菌、烟曲霉分生孢子、幽门螺杆菌[15]。6′-SL被认为可以调节婴儿的免疫反应[16]。大鼠NEC模型的研究表明，人乳低聚糖可预防由NEC引起的发病率和死亡率，最强和最一致的保护作用发生在DSLNT[17]。Good等[18]证明，喂食2FL的NEC小鼠幼仔生长更好、疾病更轻，这种作用归因于一氧化氮合酶的上调和肠灌注的恢复。本研究中人乳不同泌乳期2FL、LNFP II、6′-SL含量均大于牦牛乳，说明人乳相较于牦牛乳可能具有更多生物活性功能。

文献报道，产后10 d人乳LNFP II+LNDFP II含量最高，随后逐渐下降[19]；乳酸杆菌优势定植与乳汁LNDFH II含量呈负相关，初乳中乳酸杆菌水平较成熟乳低可能与此有关[20]。本研究结果说明，随着人乳泌乳期延长，至分娩后6 w时LNDPF II含量逐渐下降，而牦牛乳LNDPF II含量与分娩2 w及6 w人乳接近，推测牦牛乳对乳酸杆菌的影响与人乳相似。乳酸杆菌在抑制病原菌，维持微生态平衡等方面起关键作用。

4 结论

近年来，关于人乳低聚糖的研究较多，而对于牦牛乳低聚糖未见研究报道。牦牛乳作为高原地区的优势畜种，尚未被充分开发利用。本研究中共测定14种低聚糖，相较人乳低聚糖已观察到的247个品种，162种低聚糖结构特征[3]，本研究所测低聚糖的丰富程度远远不够，另外低聚糖的功能与其含量及构成比的相关性尚未明确，且低聚糖的影响因素复杂，其组成和丰度因母亲的遗传和哺乳期而异，也受妊娠年龄、母亲健康状况、婴儿性别等因素影响，有待进一步研究阐明。虽然牦牛乳低聚糖组分构成的丰富程度不及人乳，但相较牛乳，牦牛乳仍有其独特的优势，其中个别中性及酸性低聚糖组分接近甚至超过人乳，可能是一种有前途的人乳替代来源。

參考文献

[1]Thurl S，Munzert M，Boehm G，et al.Systematic review of the concentrations of oligosaccharides in human milk[J]. Nutr Rev，2017，75（11）：920-933.

[2]Clemens Kunz，Christina Meyer，Maria Carmen Collado，et al.Influence of gestational age，secretor，and lewis blood group status on the oligosaccharide content of human milk[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr，2017，64（5）：789-798.

[3]Tadasu Urashima，Jun Hirabayashi，Sachiko Sato，et al. Human milk oligosaccharides as essential tools for basic and application studies on galectins[J].Trends in Glycoscience and Glycotechnology，2018，30（172）：SE51-SE65.

[4]Thurl S，Munzert M，Henker J，et al.Variation of human milk oligosaccharides in relation to milk groups and lactational periods[J].Br J Nutr，2010，104（9）：1261-1271.

[5]Bertram Fong，Kevin Ma，Paul McJarrow.Quantification of bovine milk oligosaccharides using liquid chromatography-Selected reaction monitoring-mass spectrometry[J].Agric Food Chem，2011，59（18）：9788-9795.

[6]石永祺，梁琪，宋雪梅，等.抑制牦牛奶制品脂肪氧化的研究进展[J].食品工业科技，2020，41（3）：321-326，331.

[7]Tao N，DePeters EJ，German JB，et al.Variations in bovine milk oligosaccharides during early and middle lactation stages analyzed by high-performance liquid chromatography-chip/mass spectrometry[J].J Dairy Sci，2009，92（7）：2991-3001.

[8]PK Gopal，HS Gill.Oligosaccharides and glycoconjugates in bovine milk and colostrum[J].Br J Nutr，2000，84（Supp1）：S69-74.

[9]Urashima T，Saito T，0hmisya K，et al.Structural determination of three neutral oligosaccharides in bovine（HoIstein-Friesian） colostrum，including the novel trisaccharide;GalNAc alpha 1-3Gal beta 1-4Glc[J].Biochim Biophys Acta，1991，1073（1）：225-229.

[10]Saito T，Itoh T，Adachi S.Presence of two neutral disaccharidescontaining N-acetylhexosamine in bovine colostrum as free forms[J].Biochim Biophys Acta，1984，801（1）：147-150.

[11]Newburg DS，Ruiz-Palacios GM，Morrow AL.Human milk glycans protect infants against enteric pathogens[J].Annu Rev Nutr，2005（25）37-58.

[12]Ruiz-Palacios GM，Cervantes LE，Ramos P，et al. Campylobacter jejuni binds intestinal H（O） antigen （Fuc alpha 1，2Gal beta 1，4GlcNAc），and fucosyloligosaccharides of human milk inhibit its binding and infection[J].J Biol Chem，2003，278（16）：14112-14120.

[13]He Y，Liu S，Kling DE，et al.The human milk oligosaccharide 2-fucosyllactose modulates CD14 expression in human enterocytes，thereby attenuating LPS-induced inflammation[J].Gut，2014，65（1）：33-46.

[14]Perret S，Sabin C，Dumon C，et al.Structural basis for the interaction between human milk oligosaccharides and the bacterial lectin PA-IIL of Pseudomonas aeruginosa[J]. Biochem J，2005，389（Pt 2）：325-332.

[15]Newburg DS，He Y.Neonatal gut microbiota and human milk glycans cooperate to attenuate infection and inflammation[J].Clin Obstet Gynecol，2015，58（4）：814-826.

[16]Eiwegger T，Stahl B，Haidl P，et al.Prebiotic oligosaccharides：in vitro evidence for gastrointestinal epithelial transfer and immunomodulatory properties[J].Pediatr Allergy Immunol，2010，21（8）：1179-1188.

[17]Tanner SM，Berryhill TF，Ellenburg JL，et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis：modeling the innate immune response[J].Am J Pathol，2015，185（1）：4-16.

[18]Good M，Sodhi CP，Yamaguchi Y，et al.The human milk oligosaccharide 2-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine[J].Br J Nutr，2016，116（7）：1175-1187.

[19]Wataru S，Tadasu U，Tadashi N，et al.Determination of each neutral oligosaccharide in the milk of Japanese women during the course of lactation[J].Br J Nutr，2003，89（1）：61-69.

[20]Raul CR，Clemens K，Silvia R，et al.Association of maternal secretor status and human milk oligosaccharides with milk microbiota：an observational pilot study[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr，2019，68（2）：256-263.

Abstract：ObjectiveTo detect the composition，content and composition ratio of specific oligosaccharides in yak milk and compare it with human milk，in order to explore its advantages and disadvantages as a milk substitute.MethodThe milk samples of 20 yaks were collected at one week of birth from Zoige area，Tibet，and the human milk samples were collected from 20 women who gave birth to full-term infants at 2 weeks （control group 1） and 6 weeks （control group 2）. The components of milk oligosaccharides were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS）.ResultThe total content of 14 kinds of oligosaccharides in yak milk group was （269.9±24.1）μg/mL.The total content of 14 kinds of oligosaccharides in human milk group was（4 641.3±1 071.5）μg/mL.The content of oligosaccharide was （5 156.1±916.4）μg/mL at 2 weeks，and the content was （4 126.5±979.2）μg/mL at 6 weeks.There were significant differences between yak milk group and two human milk groups（P< 0.05）. There was no significant difference in the content of LNDPF II between yak milk group and two human milk groups（P> 0.05）.There were significant differences in 2FL，LNT，LNDPF II，3′-SL and 6′-SL between two human milk groups （P< 0.05），while there were no significant differences in others（P> 0.05）.There was no significant difference in the composition ratio of each oligosaccharides between yak milk group and two human milk groups （P> 0.05）. There were significant differences in the composition ratio of neutral/acid oligosaccharides between yak milk group and two human milk groups（P<0.05）. There was no significant difference in the composition ratio of neutral/acid oligosaccharides between two human milk groups（P>0.05）.Conclusion The composition and abundance of specific oligosaccharides in human milk can not be replaced by other animal milk.The content of oligosaccharides in yak milk is higher than that in cow milk，and some neutral and acidic oligosaccharides in yak milk are close to or even more than those in human milk，which may be a promising alternative source of human milk.

Keywords：yak milk；oligosaccharide； human milk oligosaccharides;composition