血清外泌体miR-486-3p对非小细胞肺癌早期诊断价值

王琳娜,王静

(1 青岛大学基础医学院,山东 青岛 266071; 2 山东省慢性病医院(山东省康复中心)检验科)

肺癌是临床上发病率最高的癌症之一,也是全球范围内恶性肿瘤死亡的常见原因之一[1]。非小细胞肺癌是肺癌中最常见的病理类型,其早期诊断具有一定的难度,且5年生存率较低[2]。肺癌发病早期多无典型临床表现,一经发现往往已经发展至中晚期,预后不佳。外泌体天然存在于人体体液中,其成分中含有mRNA、miRNA和蛋白质等能够携带重要生物信息的分子,肿瘤源性或肿瘤相关的外泌体含有丰富的生物成分,可作为信号信使参与前列腺癌发生、发展、进展和转移过程中细胞间通讯,是调节微环境的重要递质[3]。由于这些外泌体可以从各种体液中分离出并检测到,已成为肿瘤诊断和预后有潜力的新的生物标记物。miRNA是一种非编码小分子RNA,可调节细胞的增殖、分化和凋亡,在肿瘤的诊断、预后和治疗中发挥重要作用[4]。外泌体中的miRNA-486-3p在很多恶性肿瘤中均呈现异常表达,如肝癌、胰腺癌、肺癌或胰腺癌等[5]。本研究通过检测并分析非小细胞肺癌病人和健康体检者血清外泌体miR-486-3p表达水平差异,探究血清外泌体miR-486-3p对非小细胞肺癌的早期诊断价值。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2018年10月—2020年9月,选取本院收治的非小细胞肺癌病人120例为观察组,以同期本院体检的健康志愿者120例为对照组。观察组男93例,女27例;年龄40～79岁,平均(59.87±10.39)岁。病人纳入标准:①经影像学及病理检查确诊为非小细胞肺癌;②意识清楚,无精神系统疾病,认知正常,能够通过语言或行为与他人正常交流。排除标准:①肝肾功能严重不全者;②免疫系统疾病病人;③合并其他恶性肿瘤者;④除肺部以外其他恶性肿瘤病人。对照组男95例,女25例;年龄38～80岁,平均(60.34±11.27)岁。所有对照组受试者影像学检查、实验室检测均未见明显异常;意识清醒,无精神系统疾病。所有研究对象知情同意且研究通过本院伦理委员会审核批准。

1.2 检测指标及方法

采集两组受试者空腹静脉血5 mL,以4 000 r/min离心15 min,获取血清,应用Auto 2000发光仪(美国,SBI公司)检测血清中癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及细胞角蛋白抗原片段21-1(CYFRA21-1)水平。应用Exo Quick-TM试剂(美国,SBI公司)提取血清外泌体,按照试剂说明书操作。用磷钨酸溶液染色法染色后,透射电镜(Olympus)观察外泌体颗粒形态,纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术测定外泌体粒径大小。应用Western blot法检测外泌体表面蛋白标志物CD81和TSG101表达,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测miR-486-3p水平。收集受试者一般资料,对病人手术后肿瘤组织病理学、肿瘤病灶最大直径等进行分析。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 血清外泌体的鉴定

透射电镜观察显示,外泌体具有脂质双层囊泡结构(图1);NTA 技术观察结果显示,外泌体颗粒直径呈单峰正态分布,峰值处颗粒直径约为 90 nm,颗粒主要分布于20～300 nm(图2)。Western blot检测显示,外泌体表达CD81和TSG101表面标志蛋白(图3)。

图2 NTA 检测外泌体颗粒的直径分布

图3 Western blot方法检测外泌体表面标志蛋白 CD81以及TSG101表达

2.2 两组血清检测指标比较

观察组血清CEA、CA125、NSE和CYFRA21-1水平均高于对照组(t=10.701～31.406,P<0.01),观察组血清外泌体miR-486-3p水平显著低于对照组(t=17.155,P<0.01)。见表1和图4。

表1 两组间血清检测指标比较

图4 两组miR-486-3p表达比较

2.3 不同病理特征非小细胞肺癌miR-486-3p表达比较

观察组高龄、男性、有淋巴转移性病灶及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人的miR-486-3p表达水平均低于中青年、女性、无淋巴转移性病灶及TNM分期Ⅰ～Ⅱ期病人(t=8.168～19.658,P<0.05),而组织学诊断差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同病理特征非小细胞肺癌miR-486-3p表达比较

2.4 miR-486-3p对非小细胞肺癌的诊断效能评估

ROC曲线分析显示,血清外泌体miR-486-3p诊断非小细胞肺癌的曲线下面积(AUC)为0.781,95%置信区间(CI)为0.724～0.839,诊断的灵敏度为51.67%,特异度为98.33%,最佳界值为0.945(图5)。

图5 miR-486-3p表达诊断非小细胞肺癌的ROC曲线

3 讨 论

肺癌在临床上发病率较高,其病死率居恶性肿瘤首位,其中非小细胞肺癌病人占80%以上[6]。很多病人在明确诊断时往往已经发展至中晚期,若早期明确诊断,采取手术等措施综合治疗,5年生存率能够显著提高[7]。CEA、CA125、NSE、CYFRA21-1等肿瘤标志物是常见的肺癌筛查指标,但其灵敏度、特异度均较低,无法满足临床需求[8]。低剂量螺旋CT具有发现早期病灶的能力,但却容易引起医生对疾病的误判,导致进行一些不必要的治疗;另外,频繁的CT检查也对病人的健康不利[9]。其他检查,如支气管病理活检,属于有创检查,病人接受难度较高,对于早期非小细胞肺癌病人的诊断价值比较有限。因此,寻找特异度及灵敏度更高的检测方法是肺癌筛查的目标。

外泌体的本质是一种细胞外囊泡,其体积较小,直径通常介于20～300 nm范围内,它们主要由细胞分泌产生,并通过胞吐的方式释放进入各种体液,外泌体可在血液、尿液、汗液以及脑脊液等多种体液中存在[10]。Exocarta数据库显示,已经发现的外泌体超过万种,在各种外泌体中,其组成成分包括蛋白质、mRNA、miRNA以及脂质[11]。这些成分是体内新陈代谢的重要物质,参与体内的物质交换,因此它们在肿瘤发生的早期即可出现一定的变化,对肿瘤早期诊断以及治疗后病情的评估都有着重要的意义,已成为肿瘤血清生物标记研究的热点[12]。

本文研究主要检测血清外泌体中的miRNA。miRNA属于非编码RNA,能够通过mRNA的靶向互补作用而达成对基因表达的调控作用。目前研究认为,miRNA在肿瘤发生发展及转移的过程中有一定的临床作用,这也是癌症治疗中的新思路。有研究表明,miRNA在恶性肿瘤病人体内多呈异常表达,与多种恶性肿瘤病人的预后关系密切,具有一定的早期诊断价值。本文结果显示,观察组血清CEA、CA125、NSE、CYFRA21-1的水平均高于对照组,而血清外泌体miR-486-3p水平低于对照组,提示检测肿瘤标志物能一定程度筛选出肺癌病人。

TNM是分析肺癌的病理类型、浸润程度等方面的常用分型方式。本文研究结果显示,观察组高龄、男性、有淋巴转移性病灶及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人的miR-486-3p表达水平均低于中青年、女性、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴转移性病灶者。提示肿瘤细胞恶化程度越高,miR-486-3p表达水平可能越低。

综上所述,非小细胞肺癌在肺癌中比较常见,预后较差,早期诊断并及时予以治疗措施,能够延长病人生存时间。血清外泌体miR-486-3p属于常见抑癌miRNA,在非小细胞肺癌中呈现低水平表达,且非小细胞肺癌病人恶化程度越高,血清外泌体miR-486-3p表达水平越低,二者之间呈负相关,提示血清外泌体miR-486-3p对非小细胞肺癌具有一定的早期诊断价值。外泌体miRNA是外泌体的重要组成部分,在机体免疫、疾病进展,尤其是肿瘤的发生、发展、变化中都有参与。但是目前,临床上对于外泌体的研究还处于基础阶段,在理论体系方面尚不完善,并且在科研投入和技术支持方面都存在一定的欠缺,有待进一步深入。外泌体中的很多组成部分均有望成为疾病的无创生物标志物,为疾病的早期发现、预后评估提供可靠的临床依据。