福林酚比色法测定海藻多酚的反应条件优化

杨春妹　李志明　范先婷　沈宏

摘要： 為明确福林酚比色法测定海藻多酚含量的反应条件，本研究采用单因素试验和正交试验相结合的方法，优化了福林酚用量、碳酸钠用量、反应时间、反应温度等福林酚法测海藻多酚含量的检测条件；并进一步分析了外源物质（有机物质、无机离子）对测定结果的影响。结果表明，应用福林酚比色法测定海藻多酚的最佳反应条件为：12%福林酚5 ml、3%碳酸钠4 ml、反应温度37 ℃、反应时间30 min、最佳吸收波长730 nm；该方法的加标回收率为96.70%-103.67%，相对标准差2.68%。优化的福林酚法测得7种藻类的多酚含量为120.0～273.0 mg/L，其测定结果与国家标准茶多酚检测法的检测结果一致。外源添加1%或5%的Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cl^-、I^-、蛋白质、可溶性淀粉测定结果增加2.31%-149.79%;添加5%的Zn²⁺、CO^2-₃、NO^-₃、PO^3-₄测定结果显著降低，而山梨酸钾、葡萄糖、D-山梨醇对福林酚比色法检测海藻多酚含量无明显影响。本研究建立的海藻多酚检测法的稳定性、重现性以及加标回收率的相对标准差均低于3%，符合检测要求。

关键词： 海藻多酚；福林酚比色法；海藻；有机物质；无机离子

中图分类号： TS201.4 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2023）01-0238-08

Study on determination conditions of seaweed polyphenols by Folin-Ciocalteu colorimetry

YANG Chun-mei， LI Zhi-ming， FAN Xian-ting， SHEN Hong

（College of Resource and Environment， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract： In order to clarify the reaction conditions for the determination of seaweed polyphenol content by Folin-Ciocalteu colorimetric method， single factor test and orthogonal test were used to optimize the amount and concentration of Folin phenol， the amount and concentration of sodium carbonate， the reaction time and the reaction temperature. The effects of exogenous substances （organic substances and inorganic ions） on the determination results were further analyzed. The results showed that the optimum conditions for the determination of seaweed polyphenols by Folin-Ciocalteu colorimetric method were 12% Folin phenol 5 ml， 3% sodium carbonate 4 ml， reaction temperature 37 ℃， reaction time 30 min and the best absorption wavelength 730 nm. The recovery of this method was 96.70%-103.67%， and the relative standard deviation was 2.68%. The polyphenol content of seven kinds of algae measured by the optimized Folin-Ciocalteu colorimetric method was 120.0-273.0 mg/L， which was consistent with the results of national standard tea polyphenol detection method. Exogenous addition of 1% or 5% Cu²⁺， Ni²⁺， Mn²⁺， Cl^-， I^-， protein， soluble starch would increase the determination results by 2.31%-149.79%. The addition of 5% Zn²⁺， CO^2-₃， NO^-₃， PO^3-₄significantly reduced the determination results， while glycine， potassium sorbate， glucose and D-sorbitol had no significant effect on the determination of algae polyphenol content by Folin-Ciocalteu colorimetric method. The relative standard deviations of stability， reproducibility and the recovery of seaweed polyphenols detection method established in this study were all lower than 3%， which met the detection requirements.

Key words： seaweed polyphenols;Folin-Ciocalteu colorimetry;algae;organic matter;inorganic ions

海藻是重要的生物资源，其自身细胞为了适应低温、高盐、寡照等恶劣的海洋环境，产生次级代谢产物来保护自身细胞免受氧化应激的损伤^[1]。次级代谢产物主要包括海藻酸、海藻多酚、甘露醇、甜菜碱等^[2-3]，其中海藻多酚是以间苯三酚为基本结构单位，通过不同连接方式而构成的一类酚羟基化合物^[4]，已被证实具有较强的抗氧化、抗菌、抗癌等生物活性，广泛应用于食品、化妆品、农业等领域^[5]。

海藻多酚的种类多样，易氧化，且结构不稳定，因此在尽可能保持海藻多酚原有结构的基础上采用适宜的检测方法才能准确测定海藻多酚含量。目前关于化合物多酚含量的检测方法有光谱法、色谱法、质谱法3种^[6]。色谱法和质谱法灵敏性高，检测时间短，但操作复杂且设备昂贵。光谱法中的福林酚比色法是在碱性环境下，酚类化合物将钨钼酸还原，生成蓝色的化合物。其具有操作简单、检测快速、准确性高等特点而被广泛应用^[7-8]。但由于多酚类物质的来源、化学结构和含量不同^[9]，文献所报道的福林酚比色法检测条件（福林酚和碳酸钠浓度和用量等）都不尽相同。张洋婷等用福林酚1.0 ml，10%碳酸钠8 ml测定酸浆宿萼总多酚的含量^[10]；吴晓青等用福林酚3.0 ml，10%碳酸钠4.0 ml测定檀香橄榄总多酚的含量^[11]；高志远等用15%福林酚1 ml、5%碳酸钠0.8 ml测定甘薯块根多酚的含量^[12]；茶多酚测定的国家标准GB/T 8313—2018中用的是10%福林酚5.0 ml，7.5%碳酸钠4.0 ml^[13]。而不同的试剂用量又影响到检测结果，因此一些学者还采用单因素试验法开展了福林酚比色法的优化条件研究^[10，12]。但目前采用福林酚法检测海藻多酚的报道还比较少见。此外，海藻中富含K⁺、CI^-、Ca²⁺等无机离子及蛋白质、淀粉等有机物，这些物质对海藻多酚含量的检测是否存在影响还鲜有报道。

针对上述问题，本研究首先采用单因素和正交试验优化了福林酚法检测海藻多酚的反应条件，然后对此方法的稳定性和可靠性进行评价，并用优化的福林酚法和国家标准茶多酚检测法测定了不同藻类中多酚的含量，最后分析了外源物质对海藻多酚含量测定的影响，以期为海藻多酚的测定及应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

海藻液及7种藻类[羊栖菜 （Hizikia fusifarme）、海带（Laminaria japonica）、马尾藻 （Sargassum fusiforme）、泡叶藻（Ascophyllum nodosum）、面条藻（Durvillaea antarctica）、N藻（Lessonia Nigrescens）、F藻（Lessonia Flavicans）]购于广州申晶雅农业科技有限公司。

1.2 仪器和设备

恒温水浴锅（HWS-5A），上海百典仪器设备有限公司制造；离心机（H1850R），湘仪离心机仪器有限公司制造；754型紫外可见分光光度计，上海舜宇恒平仪器有限公司制造；恒温摇床（BSD-YX 3200），上海博迅实业公司制造。

1.3 最佳吸收波长的选择

参考茶多酚检测的反应条件，分别吸取1.0 ml样液（海藻液）和标液（0.1 mg/mL没食子酸）于试管，在每个试管中分别加入10%（体积分数）福林酚5.0 ml，摇匀。反应5 min后，加质量浓度7.5%碳酸鈉溶液4.0 ml，摇匀，室温下暗反应45 min后，在500～800 nm波长以1 nm为步长测定吸光值，选择最佳吸收波长。

1.4 福林酚比色法检测海藻多酚含量的条件优化

以上述反应条件为基础，依次改变福林酚用量（2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml 、6.0 ml、7.0 ml、8.0 ml）、福林酚体积分数（2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%）、碳酸钠用量（1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5 ml、6.0 ml、7.0 ml）、碳酸钠质量浓度（1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%）、反应温度（32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃、52 ℃、57 ℃、62 ℃）、暗反应时间（10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min） 6个因素中的一个，开展海藻多酚检测条件的单因素优化试验。

根据单因素试验结果，选取对海藻多酚含量检测敏感因素各自最好的3个水平进行正交试验，每个处理重复3次。进而明确海藻多酚含量检测的最优条件。

1.5 检测方法的评价

标准曲线绘制：以没食子酸为标准品，配制质量浓度为0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L的没食子酸工作液，用优化的福林酚法测定其吸光值。以吸光值为Y轴，没食子酸浓度为x轴，绘制标准曲线。

重复性评价：用优化的福林酚法测定5份海藻液的吸光值。计算相对标准偏差，评价该方法的重复性。

稳定性评价：海藻液在最佳条件下反应30 min后，在5 h内每隔1 h测定一次吸光值，计算其相对标准偏差，分析该方法在一定时间内的稳定性。

加标回收率试验：分别取0.5 ml质量浓度为10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L的标液于试管中，且每个试管加0.5 ml已知多酚含量的样液，用优化的福林酚法测其吸光值，评价方法的准确性。加标回收率的计算按下式进行：

加标回收率=（加标后测定的含量-样品含量）/加标量×100%。

1.6 优化的福林酚法和国家标准茶多酚检测法测定不同藻类中多酚含量

海藻经清洗、烘干、粉碎后，过0.15 mm筛备用。分别称取3.00 g样品，加水至100 ml，调节体系pH为8.5，加1.5 ml纯海藻酸裂解酶^[14]，在180 r/min、40 ℃条件下降解18 h。降解结束后，离心，收集上清液，分别用优化的福林酚法和国家标准茶多酚检测法测定多酚的含量。

1.7 有机物质或无机离子对福林酚法测海藻多酚的影响

每个试管依次添加质量浓度1%或5%阳离子（Ca²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺）、阴离子（F^-、Cl^-、I^-、CO^2-₃、NO^-₃、PO^3-₄）、有机物质（甘氨酸、山梨酸钾、蛋白质、可溶性淀粉、葡萄糖、D-山梨醇）的样液1 ml，用优化的福林酚法测其吸光值。以不添加其他成分的样液为对照，每个处理重复三次。

1.8 数据处理及统计分析

采用 Excel 2016 进行数据分析，用 SPSS statistic 25 的Duncans新复极差法进行处理间差异的显著性分析，用 Origin 2017作图。

2 结果与分析

2.1 最佳吸收波长的确定

研究结果表明福林酚与多酚的反应物在680～780 nm处有较大吸收^[10]。将样液（海藻液）、标液（没食子酸）与福林酚反应后，于500～800 nm波长扫描，其光谱吸收曲线如图1。从图1可知样液、标液的吸光值均随波长的增加而先增后减，在730 nm处达最大值，故选730 nm为福林酚法测定海藻多酚的最佳吸收波长。

2.2 福林酚法测海藻多酚的反应条件优化

福林酚剂量和体积分数对福林酚法测定海藻多酚的影响如图2A、图2B所示。随着福林酚用量或体积分数的不断增加，吸光值呈现先增后减的趋势，福林酚试剂用量在6 ml时吸光值达最大，显色效果最好（图2A）；当福林酚试剂的体积分数为12%时吸光值最大，其吸光值比体积分数为2%时增加79.18%（图2B）。

碳酸钠溶液是显色介质，其用量或质量浓度较低时，显色液呈草绿色，显色效果差，导致测定结果偏低^[15]。碳酸钠剂量和质量浓度对福林酚法测海藻多酚的影响如图2C、图2D所示。吸光值随碳酸钠剂量和质量浓度的增加也呈现先增加后减少的特征。碳酸钠剂量为2 ml时，吸光值最大。当碳酸钠用量大于3 ml时，吸光值反而因碱性过强而下降（图2C）；当碳酸钠质量浓度小于3%或大于7%时，吸光值均较低。当碳酸钠质量浓度为3%时，吸光值最大，其值比1%增加了80.24%（图2D）。

温度对福林酚法测定海藻多酚的影响如图2E所示。随反应温度的升高，730 nm吸光值亦表现出先增加后减少的趋势。当反应温度37 ℃时，吸光值最高；62 ℃的反应温度下，海藻液吸光值仅为0.489 7，相比于37 ℃时减少了24.82%。

福林酚试剂与多酚类物质的显色需要一定的时间，反应时间对显色效果的影响如图2F所示。当反应时间介于10～30 min时，吸光值随时间的延长而增加；反应时间30 min时的海藻液吸光值比10 min时增加了75.36%。而当反应时间进一步增加时，海藻液吸光值无显著变化。这说明，只要反应时间达30 min后，反应时间对吸光值将无显著影响。

上述单因素试验结果表明福林酚用量与体积分数、碳酸钠用量与质量浓度以及反应温度对海藻液730 nm吸光值有较大影响，而反应时间大于30 min后，对吸光值影响不大。进一步根据上述试验结果，选取各单素最优的3个水平（表1）进行正交试验，以确定最优的福林酚法测定海藻多酚的反应条件。

进一步利用上述5因素3水平进行L₁8（3⁵）正交试验，结果如表2所示。从表2中可以看出福林酚剂量和体积分数、碳酸钠剂量和质量浓度、反应温度对吸光值有较大的影响，优化的测试条件为12%福林酚5 ml，3%碳酸钠4 ml，温度37 ℃。从表3中可以看出，不同水平下，福林酚劑量、碳酸钠剂量、福林酚体积分数、碳酸钠质量浓度、反应温度的吸光值极差分别为0.051、0.112、0.086、0.012、0.111。因此，影响吸光值的5个因素的顺序大小依次为：碳酸钠剂量>温度>福林酚体积分数>福林酚剂量>碳酸钠质量浓度。

2.3 检测方法评价

2.3.1 标准曲线绘制 按优化的福林酚法测定质量浓度分别为0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L标准溶液（没食子酸）的吸光值，结果表明在0～50  mg/L，标准溶液吸光值和质量浓度呈良好的线性关系，其线性回归方程为Y=0.006 5x-0.000 5（R²=0.999 9）。其中Y为吸光值，x为标准溶液质量浓度（mg/L）。

2.3.2 重复性评价 按优化的福林酚法测定5份海藻液的吸光值，其结果如表4所示。5份样液的均值为0.771，相对标准差0.84%，表明优化的福林酚法重复性良好。

2.3.3 稳定性评价 海藻液在最佳条件下反应30 min后，5 h内每隔1 h测定一次吸光值，结果如表5所示。其体系反应30 min后在放置的5 h内吸光值较稳定，相对标准差为0.61%，表明优化的福林酚法稳定性良好。

2.3.4 加标回收率 向已知多酚含量的海藻液中分别加入不同质量的没食子酸，对加标后样品的总酚含量进行测定，结果如表6所示。其平均回收率为100.28%，相对标准差2.68%，说明优化的福林酚法测定海藻多酚含量较为准确。

2.4 优化法和国家标准茶多酚检测法测定不同藻类中多酚的含量

海藻生长环境条件差异大，且种类、发育阶段、采收季节等都会影响海藻多酚的种类和含量。采用优化法和国家标准茶多酚检测法测定7种海藻中多酚的含量，测定结果如图3所示。优化的福林酚法测得7种海藻的多酚含量为120.0～273.0  mg/L，且不同藻类的多酚含量从高到低依次为：羊栖菜>马尾藻>海带>泡叶藻>面条藻>N藻>F藻，其结果与国家标准茶多酚检测法相一致。值得一提的是，羊栖菜中海藻多酚的含量显著高于其他藻类，而海带、马尾藻中的多酚含量也较高，均在225.0  mg/L以上。

2.5 外源物质对福林酚法测定海藻多酚的影响

不同质量浓度阳离子对海藻多酚检测结果的影响如图4A所示。海藻样品中添加1%或5%的Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺以及5%的Fe³⁺均使吸光值显著偏高，其中样品中添加1%和5%的Mn²⁺时，吸光值比对照分别增加了97.23%和149.79%；而添加1%或5%的Zn²⁺时，吸光值显著低于对照。样品中添加1%或5% Ca²⁺以及1 % Fe³⁺对海藻多酚的检测结果无明显影响。

不同质量浓度阴离子对海藻多酚的检测结果的影响如图4B所示。Cl^-、I^-对福林酚法测定多酚影响较大，含Cl^-或I^-时，吸光值分别比对照增加了2.31%～3.97%、39.05%～69.77%。与对照相比，样品中添加5%的CO^2-₃、NO^-₃、PO^3-₄使吸光值显著低于对照，而1%的CO^2-₃、NO^-₃、PO^3-₄对测定结果无明显影响。此外，与对照相比，1% F^-使测定值偏低（P<0.05），而5% F^-使测定值偏高（P<0.05）。

不同质量浓度有机物对海藻多酚检测结果的影响如图4C所示。样品中添加不同质量浓度的蛋白质或可溶性淀粉时，其吸光值分别比对照增加了45.04%～127.07%、10.61%～19.73%，并且浓度越高，对其影响越大。而样品中添加1%或5%的山梨酸钾、葡萄糖、D-山梨醇时，其吸光值与对照均无显著差异。

3 讨论

3.1 反应条件对福林酚法测定海藻多酚的影响

在测定多酚的众多方法中，福林酚法操作简单，重现性好，是目前多酚含量测定的常用方法。其原理是在碱性溶液中，酚类化合物将钨钼酸还原（W⁶⁺变为W⁵⁺），生成蓝色的化合物，颜色的深浅与多酚含量成正比^[16]。本研究得到的优化福林酚法和国家标准茶多酚检测法在测定海藻多酚含量虽然结果基本一致，但两者在碳酸钠的使用质量浓度上有较大差异。前者用的是3.0%碳酸钠4.0 ml，后者是7.5%碳酸钠4.0 ml，这说明在福林酚法测定多酚含量的体系中，碳酸钠质量浓度并不是最重要的影响因素，其主要作用是提供一个碱性环境，只有当碳酸钠质量浓度超过一定值时，其稀释了体系中蓝色络合物，使吸光值降低^[17]。

福林酚与多酚类物质的反应需一定时间，升温可加速反应，促进有色物质生成，缩短反应时间^[18]，但温度过高会破坏多酚类物质本身的结构，且影响有色物质的生成^[19]。张娅等^[20]在测定葡萄酒中多酚含量以及詹莉莉等^[21]在测定露兜簕果实中多酚含量时均发现，当反应温度高于40 ℃时，吸光值骤降，本试验结果亦印证了这一观点。这说明高温可能导致多酚类物质降解或反应体系生成的蓝色物质在高温下稳定性变差。

3.2 有机物质或无机离子对福林酚法测定海藻多酚的影响

多酚类化合物具有多个酚基团，分子结构独特，其结构中的酚羟基有很好的螯合性能，能与金属离子发生螯合反应，且螯合产物有明显的色泽变化，进而對多酚含量测定产生干扰^[22]。本试验结果也证实了这点，即样品中添加了Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺等金属离子时，其吸光值与对照差异显著。

福林酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸盐易被蛋白质中的酪氨酸、色氨酸等残基还原， 产生蓝色混合物，因此被测样品中如果含有蛋白质，福林酚法测定的多酚含量会有一定偏差^[23]。本研究结果同样表明海藻样品中含蛋白质后，其吸光值偏高。此外，赵晓娟等^[24]研究结果表明山梨酸钾会明显干扰苹果醋中多酚含量的测定，而本研究海藻液中含山梨酸钾时测定的吸光值与对照无明显差异。这可能是不同物质中多酚的种类及含量不同造成的。有关可溶性淀粉或阴离子干扰福林酚法测定海藻液中多酚含量的原因还有待进一步研究。

4 结论

福林酚法测定海藻多酚的最佳反应条件为12%福林酚5 ml、3%碳酸钠4 ml、温度37℃、反应时间30 min、吸收波长730 nm。该条件下测得的结果准确性高，重复性好，与国家标准茶多酚测定法中的反应条件10.0%福林酚5 ml、7.5%碳酸钠4 ml、室温反应60 min、波长765 nm有一定差异，但两者均可高效测定不同藻类中的多酚含量，且测定结果无显著差异。海藻样品中含蛋白质、淀粉等有机物质以及1%或5% Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cl^-、I^-等无机离子时，均导致吸光值增加；含1%或5% Zn²⁺以及5% CO^2-₃、NO^-₃、PO^3-₄时，吸光值显著降低；山梨酸钾、葡萄糖、D-山梨醇则对测定结果无明显影响。

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（责任编辑：石春林）